2016 年度実施状況報告書

ヒト血管移植片に対する抗ドナー抗体の病的意義と免疫抑制性細胞による治療効果の検討

研究課題

研究課題/領域番号	16K10416
研究機関	北海道大学
研究代表者	後藤了一北海道大学, 大学病院, 特任助教 (10645287)
研究分担者	山下健一郎北海道大学, 医学研究科, 特任教授 (00399940)
研究期間 (年度)	2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード	ヒト化マウス / 血管移植
研究実績の概要	平成28年度はヒト腸間膜動脈を用いたヒト化マウス血管移植モデルを確立すべく、結腸切除などの手術検体から腸間膜動脈を採取、NSGマウスの腹部大動脈に置換移植した。結果、移植した全マウスが生存し、モデル確立と考えられたが、移植後２週間以内に移植血管は全て閉塞した。原因として、免疫不全マウスの種類が考えられ、研究代表者が留学先で同モデルを確立した時と同じBALB/c IL2Rg -/- Rag -/- マウスを輸入し、我々の施設で繁殖、使用することとした。そのため血管移植モデルの確立にマウスの繁殖を待つ必要があった。一方で、肝移植後のHLA class II抗体検出症例から同意を得て、抗体量をLabscreen single antigen test で測定し、抗体を含む血清を－80 度に保存した。同意を得た症例は8例、延べ11回であり、計画通り必要な抗体量の採取、保存が進んでいる。また本実験では、まず抗体のみを投与し、血管病変に及ぼす影響と機序解析を検討しているが、抗体のみで血管病変が生じなかった場合には、抗HLA抗体産生がみられる肝移植患者のリンパ球を免疫不全マウスに再構築する予定である。その準備として、マウスにヒト免疫細胞を移入した時の抗体産生性B細胞の再構築の有無につき検討した。まず健康成人(n=5) のヒト末梢血単核球2.5x106個を免疫不全マウスの腹腔内に投与し、21日目のマウス脾臓内にヒトCD45陽性細胞が21.37±2.76(Mean±SEM)％構築されることを確認した。それらヒトCD45陽性細胞の大部分はヒトCD３陽性T細胞（86.45±3.08%）であったが、ヒトCD19陽性B細胞も9.50±2.80％確認された。このことはヒト化マウス内に抗体産生性のBリンパ球が再構築できたことを示唆するが、今後実際にHLA 抗体の産生が確認されるか観察が必要である。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由血管移植モデルの作成でマウスの問題からと考えられるモデルの確立に難渋したが、新しく導入した免疫不全マウスの繁殖状況は順調であり、microsurgeryの技術は安定しているため今後モデルの確立が可能と考えている。患者血清からの抗体採取は順調に進んでおり、免疫不全マウスへのヒト免疫システムの構築は確立された。これらの状況を総括して概ね順調に進んでいると考えている。
今後の研究の推進方策	ヒト血管移植モデルは採取する血管の状態、また採取してからの冷阻血時間に左右されることが以前の研究代表者の研究で明らかになっている。短時間で数多くのモデルを作成できた方が、それぞれのモデル動物間で生じるバイアスをより小さくできると考えられる。そうした観点からはヒト皮膚を用いたヒト化マウスモデルが優れているので、その方法論も確立したい。皮膚の中は微小血管になるが血管病変の観察も可能である。また本実験の治療法の確立として挙げている免疫抑制性アナージー細胞の作成についても同時並行で進めていく必要がある。
次年度使用額が生じた理由	血管移植モデルを作成するマウスを当初NSGマウスで予定していたが、NSGマウスでは移植後ヒト血管が完全閉塞する状況であり、モデルの作成が難しいことが判明した。そのために異なる免疫不全マウスであるBALB/c IL2Rg -/- Rag -/- マウスを購入し、繁殖させた。そのためモデル作成のためにマウスの繁殖を待つ必要があり、当初計画していた平成２８年度のヒト血管移植モデルを作成することができずに、平成２８年度助成金を全て使用できなかった。
次年度使用額の使用計画	平成28年度未使用金等を新しく購入し、繁殖させているBALB/c IL2Rg -/- Rag -/- マウスの飼育費に使用する。このマウスを使用して、平成２９年度にヒト血管移植モデルを完成させる。その後本実験である抗 HLA-Class II 抗体の血管病変に及ぼす影響について検討する。抗体が血管病変を引き起こす結果が得られた場合、その機序解析として補体の関与を検討する。即ち血管障害部位のC4d免疫染色にて補体の関与、C1阻害剤による補体活性除去した場合を検討する。また自然免疫の関与としてマウスFc受容体陽性細胞の関与を検討する。