| 研究課題/領域番号 |
16K10418
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
松田 安史 東北大学, 大学病院, 助教 (00455833)
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| 研究分担者 |
桜田 晃 東北大学, 加齢医学研究所, 准教授 (60360872)
野田 雅史 東北大学, 大学病院, 講師 (70400356)
渡邉 龍秋 東北大学, 加齢医学研究所, 非常勤講師 (70636034)
岡田 克典 東北大学, 加齢医学研究所, 教授 (90323104)
星川 康 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (90333814)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 肺移植後 / 慢性拒絶反応 / リンパ新生 / 気道閉塞 / IL-17 / ヘルパーT細胞 |
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| 研究実績の概要 |
ヒト肺移植後慢性拒絶反応であるbronchiolitis obliterans syndrome (BOS)の病態は、 肺内で生じるリンパ新生(lymphoid neogenesis)と 細気管支の線維化による気道閉塞である。正常肺には認められず、慢性拒絶反応を引き起こした肺で認められるこのlymphoid neogenesisが、肺内の細気管支で起こる気道閉塞を促進させている可能性が考えられている。このlymphoid neogensisでは、通常のリンパ節の構造と同様にB細胞がリンパ濾胞を形成し、T細胞が散在して濾胞形成を促している。Lymphoid neogenesisが形成されることで、成熟したB細胞やT細胞から産生されるTNFaやLymphotoxin alfaやbetaが線維芽細胞などのstromal cellの形成を促進し、気道の線維化が誘導されると考えられる。この病態のモデルとして、ドナーの気管をレシピエントの肺内に移植するマウス肺内気管移植モデルを使用する。このマウス肺内気管移植モデルでは、syngeneic 移植では移植後２８日で気道内腔は開存しているが、allogeneic移植では、拒絶のため気道内腔は閉塞し、その周囲にはlymphoid neogenesisが認められる。閉塞した気道周囲のlymphoid neogenesisにはB細胞によるリンパ濾胞が認められ、T細胞や樹状細胞により成熟したリンパ節の構造が認められた。CD4+helper T 細胞から産生されるIL-23により、Th17細胞が活性化されIL-17を産生することにより、B細胞やT細胞からの炎症性サイトカインの産生を促す。TNFaやlymphotoxinなどの炎症性サイトカインは線維芽細胞などのstromal cellを活性化し、炎症部位での線維化が促進される。Syngeneicなマウス肺内気管移植では、移植気管の内腔はへい即せず、Allogeneicなマウス肺内気管移植モデルにおけるlymphoid neogenesisの存在と、線維化による気管内腔閉塞を確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
マウス肺内気管移植モデルの作成を行った。マウスは６～８週齢を使用した。Syngeneicとしてdonorにwild type C57BL/6、recipientとしてwild type C57BL/6を用いた。また、allogeneicとしてdonorにwild type BALB/c、recipient としてwild type C57BL/6を用いた。気管内腔の閉塞率は、syngeneic 移植では20.1±0.3%、allogeneic 移植では97.5±0.02% (N=5, p<0.05)であり、allogeneicによるマウス肺内気管移植では有意に気道が閉塞されていた。また、lymphoid neogenesisの面積はallogeneicで、syngeneic移植の1.5倍(N=5, p<0.05)で有意にallogeneic移植でのlymphoid neogenesisの範囲が大きかった。現在はこのsyngeneic移植とallogeneic移植を行った肺を摘出し、mRNAを抽出してIL-7mRNAの発現及びIL-23mRNAの発現を検討している。また、摘出肺内のCD4+T細胞の割合がallogeneic移植の肺内で増加しているかどうか、flow cytometryを用いて検討している。同時にIL-17knockoutマウスを当施設に導入するための手続きを行っている。また、IL-17阻害剤を獲得してマウスに対してどの量で投与すれば、IL-17が十分に阻害されるかを検討しているところである。
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| 今後の研究の推進方策 |
allogeneicな肺内気管移植のモデルにおいて、syngeneicに比較して肺内のIL-17が増加しているかどうか、また、CD4+helperT細胞から産生されるIL-23が増加してるかどうか、mRNAレベル及びタンパクレベルでの発現を検討していく。Allogeneicな肺内気管移植モデルにおいて、IL-17の発現の増加が認められた場合には、IL-17の阻害剤を投与することにより、allogeneic肺内気管移植において、移植された気管内腔の閉塞率が低下するかどうか、また移植気管の周囲のlymphoid neogenesisの面積が減少するかどうか検討を加えていく。加えてallogeneic肺内気管移植モデルの摘出肺を用いて、線維芽細胞などのstromal cellを活性化する炎症性サイトカインであるTNFa、Lymphotoxin alfa及びbetaの発現が、allogeneic肺内気管移植に比較してIL-17阻害剤で治療した群で低下しているかどうかをRT-PCRを用いて検討していく。IL-17knockoutマウスを当該施設に導入し、実験に使用できるようにbreedingを行う。マウス肺内気管移植に用いるマウスは8－10週齢であり、breedingしたマウスを成長させたところで、マウス肺内気管移植を行い、気管内腔の閉塞率や移植気管周囲のlymphoid neogenesisの面積の大きさを検討していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度には、マウス肺内気管移植を継続して行う予定である。Wild typeのC57BL/6及びBALB/cを用いたマウス肺内気管移植モデルを用いて、IL-17阻害剤を投与し、その効果を検討する。加えて、IL-17 knockoutマウスを用いてマウス肺内気管移植を行い、IL-17が欠損した環境における肺移植後慢性拒絶反応の抑制効果について検討する予定である。これらマウス肺内気管移植モデルの摘出肺からRNAの抽出及びタンパクの抽出を行い、炎症性サイトカインの発現やIL-17、IL-23の発現を検討していく。また、移植した肺内に存在するリンパ球を抽出してhelper T細胞のpopulationを検討していくため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
wild typeのマウスの購入費、及びwild typeとknockoutマウスの飼育費に使用する。また、RT-CPRを行うための試薬、タンパクを抽出するための試薬、flow cytometryを行うための試薬に使用する計画である。
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