| 研究課題/領域番号 |
16K10479
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| 研究機関 | 日本医科大学 |
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研究代表者 |
和田 龍一 日本医科大学, 医学部, 准教授 (20260408)
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| 研究分担者 |
坂谷 貴司 日本医科大学, 医学部, 教授 (50431903)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 乳癌 / HER2 / スプライスバリアント / delta-HER2 / 2量体 |
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| 研究実績の概要 |
HER2過剰発現乳癌は乳癌の15%を占めるサブタイプの一つである。HER2過剰発現乳癌では、HER2の種々のスプライスバリアントの発現が見られる。スプライスバリアントのひとつであるdelta-HER2の発現はHER2過剰発現乳癌におけるリンパ節転移や遠隔転移に相関している。このことから、delta-HER2の発現が癌細胞の幹細胞化や浸潤能を増強し、転移を促進している可能性がある。本研究では、HER2過剰発現乳癌におけるdelta-HER2を発現から転移へ至る分子病態を明らかにし、転移を抑制する実験的標的治療を行うことを目標としている。平成29年度の研究では、HER2を過剰発現する乳癌培養細胞株SkBR3におけるdelta-HER2発現を蛍光免疫染色とWestern blot法で確認するとともに、delta-HER2を発現する細胞株の樹立、さらにHER2スプライスバリアントの発現による分子機構の解明を目指した。乳癌細胞株SkBR3で、抗HER2抗体と抗delta-HER2抗体で免疫染色を行った。腫瘍細胞はHER2を発現しており、約1%ほどの腫瘍細胞ではdelta-HER2の発現が確認され、細胞膜下とともに細胞質内の発現も見られた。HEK293細胞にdelta-HER2を過剰発現させ、蛋白発現をWestern blot法で解析した。還元条件下では、delta-HER2は野生型HER2よりわずかに分子量の小さな蛋白質として検出されたが、非還元条件下では分子量の大きな蛋白質として検出され、2量体を形成している可能性が考えられた。delta-HER2は腫瘍細胞における発現頻度は低いものの、発現した腫瘍細胞では化学的に2量体形成し、シグナル経路を活性化している可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
本研究では、HER2過剰発現乳癌におけるdelta-HER2を発現から転移へ至る分子病態を明らかにし、転移を抑制する実験的標的治療を行うことを目標としている。これまでの研究では、1) HER2過剰発現ヒト乳癌組織におけるdelta-HER2発現と形質の解析、2) HER2過剰発現乳癌培養細胞株SkBR3における、delta-HER2発現癌細胞の形質の解析、そして3) delta-HER2HER2を過剰する培養細胞株を樹立、4) 増殖能や浸潤能といった形質の変化とそのメカニズムに検討を加えた。ヒト乳癌ではdelta-HER2は腫瘍細胞の約2-3%ほどで発現しており、細胞周期にある細胞に発現するKi-67と、delta-HER2の二重染色を行ったところ、delta-HER2を発現しない細胞は非常に高い増殖能を示すのに対し、delta-HER2を発現する細胞はKi-67が陰性で、増殖能の低い細胞であることが明らかにされた。乳癌培養細胞株SkBR3において免疫染色による検討を行ったところ、ごく一部の細胞でdelta-HER2の発現が見られ、Ki-67とdelta-HER2の二重染色では、ヒト乳癌と同様にdelta-HER2を発現しないSkBR3は増殖能が高いものの、delta-HER2を発現するSkBR3は増殖能が低いことが明らかにされた。delta-HER2を発現する乳癌細胞は、癌細胞の中で特異な形質を示す細胞であることが明らかにされた。また、delta-HER2スプライスバリアントは細胞内で2量体を形成してシグナル経路を活性化している可能性も示唆された。テトラサイクリンによりdelta-HER2の発現が誘導されるSkBR3細胞の樹立を目指しているが樹立が遅れている。現在、樹立の最終段階で、クローンの選択を行なっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成30年度は、まずdelta-HER2過剰発現乳癌細胞株を樹立すべく、クローンの選択を行い、テトラサイクリンによる発現の誘導が可能か確認を行う。一方、テトラサイクリンによる発現誘導機構のない、単純にdelta-HER2を発現するベクターも構築しており、HEK293細胞でdelta-HER2の発現を確認している。テトラサイクリンによりdelta-HER2の発現が誘導される培養細胞株が樹立できない場合には、発現ベクターの変更も考慮する。
今年度は最終年度であり、delta-HER2過剰発現乳癌細胞株を用いて、幹細胞マーカーの発現とコロニー形成能など、浸潤や転移に関わる分子の発現について検討する。また、delta-HER2は2量体を形成している可能性が示されたが、細胞内のシグナル経路についても解析を行う。テトラサイクリンによるdelta-HER2の発現の誘導が可能な細胞株を実験に用いることが望ましいと考えているが、単にdelta-HER2を発現する細胞株を用いた実験も考慮する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成29年度に計画していた、テトラサイクリンによるdelta-HER2の発現誘導が可能な細胞の樹立に遅延を生じた。このため、樹立した細胞株を用いてdelta-HER2発現前後における幹細胞マーカーの発現の変化や、浸潤や転移といった形質の評価が十分なされなかった。そのため、評価に必要な抗体や試薬、実験器具を購入しなかった。そのため予算の執行が十分行われなかった。本年度はテトラサイクリンでdelta-HER2の発現の制御の可能な細胞株を選択しており、また、テトラサイクリンによる発現の制御はできないものの、delta-HER2を発現するベクターの構築は完了しており、培養細胞にトランスフェクションして実験を開始できる状態である。delta-HER2発現に伴う、幹細胞マーカーの発現、浸潤や転移に関わる分子の発現や、その分子機構の解明のために、これまで予定していた抗体や試薬の購入する予定である。
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