| 研究課題/領域番号 |
16K10517
|
|---|
| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
|---|
研究代表者 |
石橋 由朗 東京慈恵会医科大学, 医学部, 准教授 (00246373)
|
|---|
| 研究分担者 |
志田 敦男 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (00338906)
高田 耕司 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (30179452)
松本 晶 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (20366272)
田中 雄二朗 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (90408419)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| キーワード | ユビキチン / SUMO-1 / SUMO特異的プロテアーゼ / 食道癌 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究は、最近ユビキチン-プロテアソームシステムの中で癌との関連が指摘されている SUMO 化修飾に着目し、その中でも基質（標的蛋白質）からのSUMO脱修飾に関与するSUMO特異的プロテアーゼの食道癌における意義を検証すること目的としている。本年度はその一つである SUMO-specific protease 1(SENP1)の食道癌での発現を検討した。
1．食道癌培養細胞での発現の検討
市販の抗Anti-SENP-1抗体polyclonal antibody ab3657）を用いて、各種食道癌培養細胞（KYSE50、KYSE70等）、食道上皮培養細胞においてSENP-1蛋白の発現のウエスタンブロット分析を行っている。食道癌分化度別での発現、食道癌と正常食道上皮との発現の差などを比較検討している。なお食道癌におけるこれらの検討はいまだなされていない。
2．食道癌手術症例での免疫組織化学的検討
食道扁平上皮癌手術症例のホルマリン固定、パラフィン包埋切片を用いて抗Anti-SENP-1抗体を用いた免疫組織染色を行った。染色には市販の抗体であるAnti-SENP-1 antibody ab3657（abcam）、Anti-SENP-1 antibody ab3657（ab108981）、を用いて最も染色性の優れたものを検討している。現在までの染色結果としてSENP-1の発現は、主に細胞質に認められたが、染色強度が低く染色方法、条件設定をさらに検討している。適切な免疫組織染色の条件が決定したら、食道扁平上皮癌手術症例96例を対象として、摘出標本のホルマリン固定、パラフィン包埋切片を染色し、発現レベルと臨床病理学的因子や予後との関係について検討を行う予定である。SENP-1の食道癌患者での発現については、報告例はなく本研究がはじめての検討である。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度の当初の予定からやや遅れていると判断した理由は以下のものである。
・免疫組織化学染色の染色手法確立の遅れ
当初文献上前立腺癌手術患者のホルマリン固定、パラフィン包埋切片を用いて報告されていた手法を踏襲し、使用されたものと全く同一の抗Anti-SENP-1抗体、染色手順を用いて染色を行ったが、十分な染色性が確認されなかった。抗体がpolyclonal抗体であったことからロットナンバーの違いが染色性に影響している可能性が考えられた。そのためいくつかの異なった抗Anti-SENP-1抗体を購入し、染色手順、染色条件を含め検討を行った経緯があり、予定より若干の遅れが発生している。
|
| 今後の研究の推進方策 |
今回難渋した免疫染色手法に関する課題は解決に向かっており、染色手順の確立と同時に本研究は推進されていくと考えられる。また食道癌患者のホルマリン固定、パラフィン包埋された組織の選定も終了しているため、SUMO特異的プロテアーゼのいくつかのサブタイプタイプについてもその発現を検討していくことは容易である。また以前の研究でSUMO-1の発現状況が確認できているため、各患者におけるSUMO特異的プロテアーゼ発現状況とSUMO-1との相互関係も検討できる状況にある。
また本学では2017年度に新しい共同研究施設が竣工し、本研究グループも使用が可能となる予定である。新しく整備された施設を活用していくことでより一層の研究推進が期待されている。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
初年度は免疫組織化学染色の染色手法確立が難渋し、研究の進行に若干の遅れが発生した事情があり、初年度計画していた研究が実施できなかったため次年度使用額が発生した。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
１組織採取に伴う検体調整
２SENP1発現の検討：蛋白レベルでは食道癌細胞株（KYSE110,KYSE70,KYSE50,KYSE30等予定）をSDS-PAGE試料用緩衝液で抽出し、SENP1抗体を用いてSENP1量をイムノブロットにて分析する。また同様に患者から採取した各試料（癌組織、非癌部正常組織）での検討も開始する。ホルマリン固定、パラフィン包埋された病理検体を用いて、免疫組織学的にSENP1の染色性（染色強度）、局在を確認する。さらに予後が判明している病理検体（96例)を用いて臨床病理学的因子や予後との関連を検討し、SENP1の食道癌における意義を検証する。あわせてSENP1 RNA発現も食道癌細胞株及び採取した検体で検討する。
|
