| 研究課題/領域番号 |
16K10583
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
高木 惠子 日本大学, 医学部, その他 (20339328)
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| 研究分担者 |
緑川 泰 日本大学, 医学部, 准教授 (10292905)
尾崎 俊文 千葉県がんセンター(研究所), 発がん研究グループ DNA損傷シグナル研究室, 室長 (40260252)
藤原 恭子 日本大学, 医学部, 助教 (40595708)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 肝内胆管癌 / ChB-PIP |
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| 研究実績の概要 |
1、「融合遺伝子認識Chb-PIP(クロラムブシル-PIポリアミド)の合成」ICC(肝内胆管癌)における存在が報告されているFGFR2-BICC1融合遺伝子に対するChB-PIPを設計し合成した。合成はペプチド合成器PSSM8を用いて行い、脱水縮重反応によりChBを付加した。HPLCによる精製と質量分析器による確認の後、実験に使用した。HPLCによる精製後、最終的に0.98mgのChB-PIPを得た。HPLCによる純度の解析から、若干の不純物はあるもののChB-PIPが唯一の主要なピークであり、問題なく実験に用いることができると考えた。2、「ChB-PIPと標的DNA結合能の解析(Gel shift assay)」FGFR2-BICC1融合部の配列を含む20塩基のオリゴ二本鎖DNAにFITCラベルを付加した分子を作成した。ネガティブコントロールとして全く配列の異なるFITC付加DNAも作成した。これらのDNAとChB-PIPもしくはPIP部分の配列が全く異なるネガティブコントロールChB-PIPをインキュベートし、20%のポリアクリルアミド1×TAEゲル中で電気泳動を行った。LAS4000で画像解析を行い、バンドの移動度よりChB-PIPのDNAへの結合能を判定した。その結果、ChB-PIPとともに泳動したFGFR2-BICC1融合部配列DNAはコントロールと比較して明らかにシフトしていたが、ネガティブコントロールChB-PIPにおいてはシフトは見られなかった。また、ChB-PIPによる結合配列を含まないDNA配列に対しては、ChB-PIPは結合能を有さなかった。以上よりFGFR2-BICC1融合遺伝子の融合領域に特異的に結合するChB-PIPの合成ができたと判断した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
１、Chb-PIPによる配列特異的アルキル化の確認
Chb-PIPによる配列特異的アルキル化の確認については現在条件検討を行っており、配列特異的なアルキル化の有無の確認は未だ判定できていない。
２、融合遺伝子発現安定株の作成
融合遺伝子陽性のICC細胞株の樹立については現在FGFR2-BICC1発現ベクターを導入したICC株の樹立を試行中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
Chb-PIPによる配列特異的アルキル化の確認、融合遺伝子発現安定株の作成を行う。作成された融合遺伝子発現安定株に対して、今回合成したChB-PIPを濃度別に投与し、導入されている融合遺伝子に特異的アルキル化が起きているかどうかの確認を行う。次に、ChB-PIP投与により融合遺伝子発現安定株でのFGFR2-BICC1陽性細胞特異的に抗腫瘍効果を示すかどうかを検討する。また、ChB-PIP投与により、過剰発現させている融合遺伝子の発現に変化があるかどうかを検討し、ChB-PIP投与による下流遺伝子の発現への影響を確認する。その後ChB-PIPのin vitroにおける特異的アルキル化能と抗腫瘍効果の確認を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
現在進捗状況として、やや遅れており、Chb-PIPによる配列特異的アルキル化の確認が未だ判定できておらず、また、融合遺伝子発現安定株の作成を試行中である。そのため、それらに使用するはずであった試薬などの消耗品を購入しなかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
１、蛍光色素でラベルした標的DNAをChB-PIPとともにインキュベートし、熱処理後ポリアクリルアミドにて展開する。これにより、標的配列特異的なアルキル化の有無を判定する。２、FGFR2-BICC1発現ベクターを導入したICC株の樹立を試行し、抗腫瘍効果を検討する。
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