| 研究課題/領域番号 |
16K10583
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
高木 惠子 日本大学, 医学部, 研究医員 (20339328)
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| 研究分担者 |
緑川 泰 日本大学, 医学部, 准教授 (10292905)
尾崎 俊文 千葉県がんセンター(研究所), 発がん研究グループ DNA損傷シグナル研究室, 室長 (40260252)
藤原 恭子 日本大学, 歯学部, 准教授 (40595708)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 肝内胆管癌 / ChB-PIP |
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| 研究実績の概要 |
融合遺伝子作製準備として、これまでにFGFR2-BICC融合遺伝子の融合領域に特的に結合するChB-PIP(クロラムブシル-PIポリアミド)の合成、確認を行った。
次に、融合遺伝子発現株の作製にとりかかった。その後、一過性発現を確認することができたため、安定株の樹立に取りかかった。
安定株樹立のため、Huh28、TKKK株にリポフェクタミン3000による遺伝子導入を行った後にG418(Geneticin)を用いてセレクションを行い、ある程度の大きさになったG418耐性コロニーを回収した。回収した細胞は、96wellプレートのスモールスケールより徐々にスケールアップをした。それら細胞よりRNAを抽出後、Real time PCRによりコントロール群と融合遺伝子プラスミド導入群との 遺伝子発現量を測定した。Huh28株においては、細胞の発育に時間がかかったり、その他の問題で遅延はしたが、コントロール群と比較して、融合遺伝子プラスミド導入群での遺伝子発現量は有意に高発現であった。再実験を行ってもコントロール群と比較して、融合遺伝子プラスミド導入群で遺伝子発現量は高発現であった。これによりHuh28株において安定株の作製が確認できたと考えられた。
TKKK株においてもHuh28株と同様にセレクションを行い、ある程度の大きさになったG418耐性コロニーを回収し、96wellプレートのスモールスケールよりスケールアップを試みた。繰り返し実験を行ったが細胞が育たずTKKK株での安定株作成実験は断念した。
次に、Huh28株でのウエスタンブロットによる安定株発現の確認を行うため、蛋白を回収後ソニケーションを行いARVOにより蛋白質定量を行った。繰り返し行ったが、蛋白質が十分量回収できず実験が進まなかった。
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