| 研究課題/領域番号 |
16K10586
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
山下 洋市 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 准教授 (00404070)
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| 研究分担者 |
井嶋 博之 九州大学, 工学研究院, 教授 (10274515)
辻田 英司 独立行政法人国立病院機構(九州がんセンター臨床研究センター), その他部局等, 消化器外科医師 (20389414)
相島 慎一 佐賀大学, 医学部, 教授 (70346774)
白木川 奈菜 九州大学, 工学研究院, 助教 (90724386)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ミニチュアヒト肝臓 / 肝細胞癌 / 浸潤・転移 / ex vivoモデル / ヒト初代培養肝細胞 / ヒトiPS細胞 |
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| 研究実績の概要 |
平成29年度の実験到達目標は「ミニチュアヒト肝臓を用いた肝細胞癌の循環・転移機序の解明」である。ラット摘出肝に緩衝液であるトリトンXを門脈から還流する事で、精緻な脈管構造を維持した脱細胞鋳型肝臓の安定した作成が可能となった。また、ミニチュアヒト肝臓のex vivo長期還流培養を可能にするために、新しく人工肺装置を回路に組み込み、最大2日間のex vivo還流培養が可能となった。この循環回路にキーエンスを組み込み、GFPやRFPをコードしたplasmidをエレクトロポレーション法で導入してマーキングしたヒト肝癌細胞株（Hep 3B）を可視できるシステムを構築した。
当院倫理委員会の承認のもと、患者からインフォームド・コンセントを得て、肝門部胆管癌、転移性肝癌、肝内胆管癌などウイルス肝炎や肝硬変合併のない肝切除症例の切除標本非癌部より、コラーゲナーゼ還流法を用いてヒト初代培養肝細胞を得るプロトコールの確立を目指して実験を重ねている。これまで、10例近く症例を重ねているが、細胞収率・生存率などがまだ安定しないのが状況である。
細胞量の確保のために、採取したヒト初代培養肝細胞の不死化を試みている。初代培養肝細胞にレンチウイルスを用いてSV40 T antigen、E6/E7&hTERTなどの遺伝子を導入して不死化させる事に成功した。In vitroでは増殖しないヒト初代培養肝細胞に増殖能を供与する事ができたが、G6Pやα1ATなどの肝特異遺伝子の発現が初代培養肝細胞に比して1/10に低下しており、肝特異機能を喪失して可能性が高いと考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
平成28年度の進捗の遅れを完全に取り戻す事ができなかった。平成28年の4月に研究代表者が九州がんセンターから熊本大学へ異動した。熊本大学ではラット実験の実績がなく、動物実験計画書の提出からのスタートであった。また4月の熊本地震により、実験環境が壊滅的に破壊され、本格的な実験再開は8月からとなった。ヒト初代培養肝細胞採取に関しても倫理委員会の承認からのスタートとなった。平成29年2月に熊本大学でのラット実験が承認され、ラット脱細胞鋳型肝臓の安定した供給が可能となった。また、細胞源であるヒト初代培養肝細胞採取に関しても、平成29年3月に倫理委員会の承認を受けた。これまでに、ヒト初代培養肝細胞採取に関しては豊富な経験を有してはいるが、安定した採取を実現するプロトコールの確立に難渋している。また、本実験系を実現するためには、最低7日のex vivo培養が必要と考えられるが、まだ長期還流培養を可能にする安定した酸素供給系を構築できずにいる。ミニチュアヒト肝臓を構築するための肝細胞量確保のために、ヒト初代培養肝細胞の不死化に成功したが、同時に肝特異機能が著しく喪失している事が判明し、ミニチュアヒト肝臓の細胞源として適格かどうか不安が残る。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成30年度の研究到達目標は「ミニチュアヒト肝臓を用いたHCCの循環・転移機序の解明」である。まずは、安定したヒト初代培養肝細胞採取のプロトコールを確立し、ex vivo循環培養回路内の人工肺など酸素供給系を改良して、最低7日間循環培養ができる回路を構築して、ミニチュアヒト肝臓の創成を2018年6月までに達成する。肝臓組織構築精度の評価は3D-CTと病理組織（H&E染色）で行う。また、肝特異機能解析として、アルブミンの分泌やアンモニア代謝を循環回路内で評価する。
ヒトミニチュア肝臓のex vivo還流培養系を確立し、GPFまたはRFP遺伝子導入ヒト肝癌株を肝臓被膜下に接種して担癌モデルを作る。浸潤・転移課程をキーエンスやイメージアナライザーでモニタリングし、定期的に組織サンプルを採取して病理組織学的に肝癌の浸潤課程を評価する。
還流培養において培養液リザーバーに流れ出した細胞が「Cancer Front」を形成する細胞群と考えられる。この細胞群と肝腫瘤でcDNAマイクロアレイやプロテインチップアレイを行い、Cancer Frontを形成する細胞群の分子生物学的特徴を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
理由：ヒト初代培養肝細胞採取に関しては豊富な経験を有してはいるが、安定した採取を実現するプロトコールの確立に難渋し、当初予定していた計画まで進むことが出来なかった。
使用計画:研究費は、実験動物購入・飼育費及び実験試薬・消耗品購入費に充てたい。また、研究データの管理、資料整理を行ってもらうための事務補佐員の雇用経費に充てたいと考える。
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