| 研究課題/領域番号 |
16K10729
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
日宇 健 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 客員研究員 (00404260)
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| 研究分担者 |
堀江 信貴 長崎大学, 病院(医学系), 講師 (70380912)
松尾 孝之 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 教授 (00274655)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 神経幹細胞 / 脳梗塞 / シナプス |
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| 研究実績の概要 |
1. 脳梗塞モデルの確立：梗塞モデルとしてdistal MCA occlusion modelを作成。MCA 凝固切断+一側総頸動脈30分閉塞にてMCA領域皮質の梗塞を作成。梗塞範囲もほぼ一定のモデルとなった。
2. 脳実質内投与の確立：ヒト由来幹細胞をperi-infarct areaへの定位的脳実質内投与を行う。peri-infarct areaに計4箇所の投与とした。
3. Functional recovery, 脳梗塞サイズの変化, 幹細胞の生存率の検討, シナプスの定量化 。梗塞1週間後にヒト神経幹細胞を患側大脳皮質に定位移植(1×105 cells/site, 3-4 sites)し, cylinder test, whisker-paw test, modified neurological severity score testにて1週毎に機能評価を行った。定位移植3週-4週間後に細胞移植群で機能回復を来した。
梗塞サイズには細胞移植群と差は認めなかった。
皮質第2-3、5層でのGlutamateシナプス、GABAシナプスの比率、synaptic densityを明らかにする。前シナプスマーカーと後シナプスマーカーのcolocalizationのあるものをシナプスと定義しグルタミン酸シナプスとGABA シナプスの定量化を行った。synapsinとPSDのcolocalizationのあるものをグルタミン酸 シナプスと定義した。移植後4週間後に梗塞周辺部のシナプスの定量化を行い, グルタミン酸シナプスの増加を認めた。一方でGABAシナプスは増加していなかった。この変化は移植1週間後には認めなかった。機能回復が得られる移植4週間後にグルタミン酸シナプスの増加を認め, グルタミン酸シナプスが機能回復に寄与していることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
脳梗塞モデルの完成 1. 脳梗塞モデルの確立
適切な梗塞巣をもつモデルを確立する。梗塞モデルとしてdistal MCA occlusion model はMCA 凝固切断+総頸動脈30分閉塞する。2. 脳実質内投与の確立
ヒト由来幹細胞をperi-infarct areaへの定位的脳実質内投与を行った。
3. Functional recovery, 脳梗塞サイズの変化, 幹細胞の生存率の検討, シナプスの定量化。高解像度イメージングであるarray tomographyを用いて, シナプスの定量化を行った。移植後1, 4週間後にperiinfarctの組織を抽出。70nmの連続30-40切片とし蛍光顕微鏡を用いて3D再構成を行う。解析（シナプスのカウント）にはMat Labを使用しコンピュータープログラムで定量化を行った。以上は概ね達成された。今後はホスト環境の変化につき主に組織学的に評価する。
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| 今後の研究の推進方策 |
ホストの梗塞部周囲peri-infarct areaにおける環境変化についての検討
脳梗塞後に移植した幹細胞を抽出しgene expression profileを明らかとする(microarray analysis)。
ここでsynapseの増生に関与する分泌因子を5-10程度に絞る。
シナプスの増生に関与する分泌因子のneutralizationを行いin vitroで明らかとする。RatからのPrimary cortical neuronを用いてヒト神経幹細胞とのcoculture(non-contact)でsynapseの増生を確認する。次に分泌因子（neutralizationを行った抗体の有無で分ける）の関与を同定。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
移植後4週間後に梗塞周辺部のシナプスの定量化を行い, グルタミン酸シナプスの増加を認めた。この変化は移植1週間後には認めなかった。機能回復が得られる移植4週間後にグルタミン酸シナプスの増加を認め, グルタミン酸シナプスが機能回復に寄与していることが示唆された。これらの結果が有意差を持って証明されたため実験動物ラット購入額あるいは麻酔用ガスの使用を減らすことができた。この費用を次の研究計画で使用させて頂きたい。
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| 次年度使用額の使用計画 |
脳梗塞のホスト環境の変化につき脳梗塞後に移植した幹細胞を抽出しgene expression profileを明らかとする(microarray analysis)。
ここでsynapseの増生に関与する分泌因子を5-10程度に絞る。この際に以下の費用が生じる。1実験動物ラット購入飼育 2試薬 （TTC, cresylviolet）3麻酔用ガス (アイソフルレン、酸素、圧縮空気）4試薬 (一次抗体、二次抗体) 5 mircoarray
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