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2016 年度 実施状況報告書

脳梗塞に対する幹細胞療法のシナプス増生のメカニズムの解明

研究課題

研究課題/領域番号 16K10729
研究機関長崎大学

研究代表者

日宇 健  長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 客員研究員 (00404260)

研究分担者 堀江 信貴  長崎大学, 病院(医学系), 講師 (70380912)
松尾 孝之  長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 教授 (00274655)
研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード神経幹細胞 / 脳梗塞 / シナプス
研究実績の概要

1. 脳梗塞モデルの確立:梗塞モデルとしてdistal MCA occlusion modelを作成。MCA 凝固切断+一側総頸動脈30分閉塞にてMCA領域皮質の梗塞を作成。梗塞範囲もほぼ一定のモデルとなった。
2. 脳実質内投与の確立:ヒト由来幹細胞をperi-infarct areaへの定位的脳実質内投与を行う。peri-infarct areaに計4箇所の投与とした。
3. Functional recovery, 脳梗塞サイズの変化, 幹細胞の生存率の検討, シナプスの定量化 。梗塞1週間後にヒト神経幹細胞を患側大脳皮質に定位移植(1×105 cells/site, 3-4 sites)し, cylinder test, whisker-paw test, modified neurological severity score testにて1週毎に機能評価を行った。定位移植3週-4週間後に細胞移植群で機能回復を来した。
梗塞サイズには細胞移植群と差は認めなかった。
皮質第2-3、5層でのGlutamateシナプス、GABAシナプスの比率、synaptic densityを明らかにする。前シナプスマーカーと後シナプスマーカーのcolocalizationのあるものをシナプスと定義しグルタミン酸シナプスとGABA シナプスの定量化を行った。synapsinとPSDのcolocalizationのあるものをグルタミン酸 シナプスと定義した。移植後4週間後に梗塞周辺部のシナプスの定量化を行い, グルタミン酸シナプスの増加を認めた。一方でGABAシナプスは増加していなかった。この変化は移植1週間後には認めなかった。機能回復が得られる移植4週間後にグルタミン酸シナプスの増加を認め, グルタミン酸シナプスが機能回復に寄与していることが示唆された。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

脳梗塞モデルの完成 1. 脳梗塞モデルの確立
適切な梗塞巣をもつモデルを確立する。梗塞モデルとしてdistal MCA occlusion model はMCA 凝固切断+総頸動脈30分閉塞する。2. 脳実質内投与の確立
ヒト由来幹細胞をperi-infarct areaへの定位的脳実質内投与を行った。
3. Functional recovery, 脳梗塞サイズの変化, 幹細胞の生存率の検討, シナプスの定量化。高解像度イメージングであるarray tomographyを用いて, シナプスの定量化を行った。移植後1, 4週間後にperiinfarctの組織を抽出。70nmの連続30-40切片とし蛍光顕微鏡を用いて3D再構成を行う。解析(シナプスのカウント)にはMat Labを使用しコンピュータープログラムで定量化を行った。以上は概ね達成された。今後はホスト環境の変化につき主に組織学的に評価する。

今後の研究の推進方策

ホストの梗塞部周囲peri-infarct areaにおける環境変化についての検討
脳梗塞後に移植した幹細胞を抽出しgene expression profileを明らかとする(microarray analysis)。
ここでsynapseの増生に関与する分泌因子を5-10程度に絞る。
シナプスの増生に関与する分泌因子のneutralizationを行いin vitroで明らかとする。RatからのPrimary cortical neuronを用いてヒト神経幹細胞とのcoculture(non-contact)でsynapseの増生を確認する。次に分泌因子(neutralizationを行った抗体の有無で分ける)の関与を同定。

次年度使用額が生じた理由

移植後4週間後に梗塞周辺部のシナプスの定量化を行い, グルタミン酸シナプスの増加を認めた。この変化は移植1週間後には認めなかった。機能回復が得られる移植4週間後にグルタミン酸シナプスの増加を認め, グルタミン酸シナプスが機能回復に寄与していることが示唆された。これらの結果が有意差を持って証明されたため実験動物ラット購入額あるいは麻酔用ガスの使用を減らすことができた。この費用を次の研究計画で使用させて頂きたい。

次年度使用額の使用計画

脳梗塞のホスト環境の変化につき脳梗塞後に移植した幹細胞を抽出しgene expression profileを明らかとする(microarray analysis)。
ここでsynapseの増生に関与する分泌因子を5-10程度に絞る。この際に以下の費用が生じる。1実験動物ラット購入飼育 2試薬 (TTC, cresylviolet)3麻酔用ガス (アイソフルレン、酸素、圧縮空気)4試薬 (一次抗体、二次抗体) 5 mircoarray

  • 研究成果

    (7件)

すべて 2017 2016

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (4件)

  • [雑誌論文] The surgical management and histology of symptomatic large extracranial internal carotid artery aneurysms2017

    • 著者名/発表者名
      Takeshi Hiu, Tsuyoshi Izumo, Tsutomu Yoshioka, Shiro Baba, Hiroaki Yokoyama, Isao Shimokawa, Kazuhiko Suyama, Takayuki Matsuo, and Izumi Nagata
    • 雑誌名

      Annals of Neurodegenerative Disorders

      巻: 印刷中 ページ: 印刷中

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Point-by-point parent artery/sinus obliteration using detachable, pushable, 0.035-inch coils2016

    • 著者名/発表者名
      Yamaguchi S, Horie N, Hayashi K, Fukuda S, Morofuji Y, Hiu T, Izumo T, Morikawa M, Matsuo T
    • 雑誌名

      Acta Neurochir (Wien)

      巻: 158 (11) ページ: 2089-2094

    • 査読あり
  • [雑誌論文] A Case of Ruptured Internal Carotid-Posterior Communicating Artery Aneurysm Associated with Acute Subdural Hematoma, Extending from the Interhemispheric Space to the Posterior Fossa2016

    • 著者名/発表者名
      Otsuka H, Fukuda Y, Yoshimura S, Somagawa C, Hiu T, Ono T, Ushijima R, Toda K, Tsutsumi K
    • 雑誌名

      No Shinkei Geka

      巻: 44 (6) ページ: 517-24

    • 査読あり
  • [学会発表] 遠隔地発症急性期脳梗塞に対する24時間体制下のヘリ搬送システムによるdrip/ship/retrieve法の最新事情と展望2016

    • 著者名/発表者名
      日宇 健, 佐藤 慧, 中道 親昭, 岩永 洋, 日宇 宏之、 小野 智憲, 牛島 隆二郎、戸田 啓介、堤 圭介
    • 学会等名
      第32回日本脳神経血管内治療学会学術総会
    • 発表場所
      神戸国際会議場 (兵庫県神戸市)
    • 年月日
      2016-11-24 – 2016-11-26
  • [学会発表] Twig-like networkを伴う中大脳動脈主幹部 (M1) 形成不全 ― 頭蓋内出血で発症する病態の多様性について ―2016

    • 著者名/発表者名
      日宇 健, 松永裕希, 福田雄高, 平山航輔, 吉村正太, 杣川知香, 佐藤 慧, 小野智憲, 牛島隆二郎, 戸田啓介, 堤 圭介
    • 学会等名
      第59回日本脳循環代謝学会学術集会
    • 発表場所
      あわぎんホール (徳島県徳島市)
    • 年月日
      2016-11-11 – 2016-11-12
  • [学会発表] 24時間体制下のヘリ搬送システムによるdrip/ship/retrieve法の最新事情と展望 遠隔地で発症する急性期脳梗塞例を中心に2016

    • 著者名/発表者名
      日宇 健, 佐藤 慧, 中道 親昭, 岩永 洋, 日宇 宏之、 小野 智憲, 牛島 隆二郎、戸田 啓介、堤 圭介
    • 学会等名
      日本脳神経外科学会第75回学術総会
    • 発表場所
      福岡国際会議場 (福岡県福岡市)
    • 年月日
      2016-09-29 – 2016-10-01
  • [学会発表] Teleradiologyとヘリ搬送を活用したhub & spoke型networkの構築 -遠隔地発症例へのdrip/ship/retrieve法-2016

    • 著者名/発表者名
      日宇 健, 福田 雄高, 中道 親昭, 岩永 洋, 日宇 宏之、 小野 智憲, 牛島 隆二郎、戸田 啓介、堤 圭介
    • 学会等名
      第41回日本脳卒中学会総会
    • 発表場所
      ロイトン札幌 (北海道札幌市)
    • 年月日
      2016-04-14 – 2016-04-16

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公開日: 2018-01-16  

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