マイクログリア制御による頭部外傷後脳損傷の治療

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K10741
• 研究機関: 日本大学
• 研究代表者: 茂呂 修啓 日本大学, 医学部, 助手 (00386012)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: アストロサイト / マイクログリア / 脳挫傷

研究実績の概要

これまで我々は脳挫傷による脳損傷の治療として、グリア細胞が励起する炎症反応を抑制することにより治療効果を得ようと研究を行ってきた。外傷という刺激を受けたアストロサイトはカルシウムウェーブを形成し、これは近隣のマイクログリアを活性化させながら広がっていく。このカルシウムウェーブ自体を拮抗することにより、確かにマイクログリアの活性化を抑制可能であった。しかし実際の治療を考えた場合、この方法ではアストロサイトの正常活動自体も拮抗する可能性が高く、そうであればウェーブ自体を拮抗するより、ウェーブから信号を受けるマイクログリア上の受容体を拮抗したほうが治療効果は高く、副作用も少ないのではないかと考えた。本研究ではマイクログリアがカルシウムウェーブから信号を受け取る際に重要な働きをすると報告されている、マイクログリア上のP2受容体を拮抗することがラット脳挫傷モデルにおいて有効かを検討した。
予定通り平成28年度はモデルの作製を行った。ラット脳挫傷モデルとして汎用されているcortical contusion injuryを使用した。脳挫傷作成後ラット背部皮下に持続的微量投薬用の浸透圧ポンプを移植し、脳挫傷中心部に薬物が投与されるようにした。Naïve群とコントロール群の他に、ポンプからP2X4受容体拮抗薬である5-BDBDを投与した群、P2X7受容体拮抗薬であるAZ11645373を投与した群、およびこの両拮抗薬を投与した群を作製した。脳の摘出は3日後に行った。摘出した脳からマイクログリアの活性化を観察するためのウェスタンブロッティング用の検体、各種サイトカインやケモカインのmRNA測定のための検体を保存した。ウェスタンブロッティング用の検体はタンパクを精製し、総蛋白量を定量した。mRNA測定用の検体はRNA精製後に逆転写しcDNAを作製した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

おおかた研究実施計画通りの進行状況である。ウェスタンブロッティングやPCRなどの解析法の条件出しはすでに終了していることから、今後の解析はこのまま順調に進んでいくものと思われる。
当初予期していなかった点としては、外傷7日後の脳を解析すると活性化しているマイクログリアの数が極端に少なく、炎症が自然に寛解しているようである。したがって7日モデルのサイトカインの定性、定量は必要性が低いと思われる。

今後の研究の推進方策

平成29年度前半は採取した組織の解析を引き続き行っていく予定である。ウェスタンブロッセィングやPCRなどはこれまで我々が使用してきた条件通りに解析していく。
平成29年度後半は新たにモデルを作製し組織染色用の組織を採取する。これを用いて外傷後急性期に外傷組織周辺の大脳皮質、同側の海馬のCA3、対側の大脳皮質とCA3のFluoro-Jade染色を行う。これは外傷後の二次損傷により死亡したあるいは死にゆく細胞数を定量するためである。
平成30年度は最終的にこれらの拮抗薬が機能予後を改善するかを行動実験を行い解析していく予定である。

次年度使用額が生じた理由

当初の予定では初年度に、PCR法を用いてインターロイキンやTNFαなどのサイトカインの測定とウェスタンブロッティングを用いて活性型マイクログリアの定量を行う予定であった。しかしまずはウェスタンブロッティングを完全に解析終了してからPCRを行うこととした。このためPCR関連の試薬、消耗品を購入しなかったため残額が生じた。

次年度使用額の使用計画

当初一年目に行う予定であったPCRを二年目に実施することとしたため、RTPCRに使用するキットなどを購入する費用に充てる。