| 研究課題/領域番号 |
16K10752
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| 研究機関 | 浜松医科大学 |
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研究代表者 |
鮫島 哲朗 浜松医科大学, 医学部, 講師 (00295213)
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| 研究分担者 |
難波 宏樹 浜松医科大学, 医学部, 教授 (60198405)
山崎 友裕 浜松医科大学, 医学部附属病院, 助教 (40781050)
小泉 慎一郎 浜松医科大学, 医学部附属病院, 助教 (10456577)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | non-viral vector / HSVtk / 自殺遺伝子幹細胞療法 |
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| 研究実績の概要 |
非ウイルス的遺伝子導入法による自殺遺伝子幹細胞療法の開発とグリオーマ治療への応用を目指し、HSVtk遺伝子導入エピソーマルベクターの作成を進め、リポフェクション、エレクトロポレーションによる遺伝子導入の検証を行ってきた。preliminaryに作成した7.5KbのHSVtk発現プラスミドをエレクトロポレーションにて導入したところ40%の導入効率が得られ、ガンシクロビルに対する反応性も確認でき順調な経過と思われたが、HSVtk発現エピソーマルベクターはベクターサイズが大きいためほとんど導入されず断念した。そこで申請者らはHSVtk遺伝子及びテロメラーゼ(hTERT)遺伝子を安定的に発現するプラスミドベクターを作成し、PiggyBacシステムを用いた非ウイルス的HSVtk遺伝子導入幹細胞株の樹立に着手した。hTERT遺伝子を導入することにより、細胞の増殖期間が延長し株化に要する時間が短縮するのみならず、幹細胞性の維持が担保されるため、本法は有効性が高く、安全で高品質な細胞製剤の低コスト新規作成法となると考え実験に着手した。HSVtk発現幹細胞の作成に際し、使用する幹細胞候補として臨床応用を見据え、生体組織由来幹細胞が最適と考え、GMP基準に準じた細胞製剤化を行っている企業と提携し、間葉系幹細胞を安定供給していただくこととなった。まずHSVtk遺伝子、hTERT遺伝子、選別に必要なHygromycin耐性遺伝子、評価モニターとなるGFP遺伝子、合計4種遺伝子を同一コンストラクトに集約したプラスミドベクターの作成を行った。本プラスミドをリポフェクションにて導入したところベクターサイズが大きいためか、安定株が得られるほど十分な導入効率が得られなかった。そこで、2種類ずつ目的遺伝子が配列されたプラスミドを作成し、co-transfection法を用いた遺伝子導入を行っている。
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