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前年度で作成した新薬（CA9AO）の効果も含め、放射線耐性株樹立が必要なため、定期的に小線量の放射線照射を継続して継代培養を行ったが、各細胞株において、放射線耐性株の樹立は、過去の実験同様困難であった。そこで放射線耐性獲得を有するといわれる低酸素耐性株で実験を継続することとした。低酸素継代株は、放射線耐性は認められないものの、骨肉腫細胞株の一部は抗がん剤耐性を示した。
低酸素・酸性環境を同時に調整する因子として、HIF-1、CA9、HES-1を同定しているが、これら発現については、低酸素環境培養株では、高率に発現していることは、すでに確認済みのため、最も低酸素の調整因子としてかかわるCA9を第一調整因子として実験を継続した。また、腫瘍細胞浸潤能を調べるため、scratch migration assayを行ったが、低酸素耐性株では高浸潤能を示し、CA9阻害剤併用で浸潤能の抑制効果を認めた。そこで、低酸素耐性株に対して、CA9阻害剤を先に投与し、AOによる放射線治療効果を検討することとした。耐性株をヌードマウスの背部に移植し、CA9阻害剤を局所投与。直後にAOを尾静脈投与し蛍光イメージングシステムを用いてAOの集積を確認した。
耐性株でのAO集積は、CA9阻害剤投与群・非投与群ともに集積の増加が確認された。腫瘍病変に対し、5Gyの放射線照射を行っても、単回照射では、非耐性株と比べても、有意な腫瘍縮小効果は見られなかった。しかし、肺転移について、経時的に確認を行うと、CA9阻害剤投与群では、肺転移数の抑制効果が認められ、局所腫瘍縮小効果は差異がないものの、肺転移抑制効果については、CA9阻害剤によると思われる効果が期待できた。CA9阻害剤同様、HES-1、HIF-1については、低酸素異性株で高発現を認めるものの、阻害剤による発現の抑制が困難で、十分な腫瘍縮小効果は得られなかった。
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