| 研究課題/領域番号 |
16K10889
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| 研究機関 | 埼玉医科大学 |
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研究代表者 |
中村 春彦 埼玉医科大学, 医学部, 助教 (60755677)
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| 研究分担者 |
廣瀬 旬 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (00456112)
門野 夕峰 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (70401065)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 骨代謝 / 破骨細胞 / Vopp1 |
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| 研究実績の概要 |
予備実験においては、破骨前駆細胞ならびにRANKL刺激により分化した破骨細胞に対してChIPシークエンス法を用いてヒストン修飾パターンの全ゲノム的解析を行い、ヒストン修飾が活性型に変化する遺伝子群を同定し、さらにRNAシークエンスで、RANKL刺激後に発現量が増加しているものとしてVopp1を候補遺伝子として選択した。平成28年度には、そのデータを用いてVopp1のヒストン修飾変化について解析し、RANKL刺激前ではH3K4とH3K27のトリメチル化の両方の修飾がされているが、破骨細胞への分化に伴いH3K27のみが脱メチル化されることを確認した。マウスの長管骨骨髄から細胞を採取し、M-CSF存在下で2日間培養後、さらにM-CSFとRANKLの存在下で3-4日間培養することで破骨細胞様のTRAP陽性多核細胞へと分化させる系において経時的にRNAを採取し、それを用いたRealtime PCRを行い、破骨細胞の分化に伴いVopp1の発現が増加していることを観察した。また、Vopp1のノックダウンによる破骨細胞分化、機能、生存への影響の解析を行うために、Vopp1のshRNA (short hairpin RNA)を RNAi ConsortiumのshRNA ライブラリーから得られる配列をもとに構築し、標的 RNA を RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen Vector に挿入してベクターを作成した。これを上記の破骨細胞分化系に用いてVopp1の発現抑制し、破骨細胞分化及び機能、生存能を解析する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成28年4月から所属施設が変更となったため、実験を開始するまでの準備時間を要したため。
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| 今後の研究の推進方策 |
RANKLによる破骨細胞分化系においてshRNAを用いてVopp1の発現を抑制し、破骨細胞の形態や数、破骨細胞関連分子の発現量の対照群に対する比較を通じて分化におこる変化を解析する。また、Vopp1のfloxマウスが販売されている(B6N(Cg)-Vopp1tm1e.1(EUCOMM)Wtsi/J , The Jackson Laboratory)ので、これを購入し、Ctsk-Creマウスと掛け合わせ、Vopp1の破骨細胞特異的遺伝子欠損マウスを作成し、繁殖を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成28年4月に研究代表者の所属施設が変更となったため、実験開始の準備に時間を要し、新施設での実験がやや遅延しているため
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| 次年度使用額の使用計画 |
当初の予定通りの実験をややペースを早めて行う予定である。
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