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2016 年度 実施状況報告書

microRNAとエクソソーム解析によるメカニカルストレスの関節軟骨への作用解明

研究課題

研究課題/領域番号 16K10905
研究機関岡山大学

研究代表者

大月 孝志  岡山大学, 保健学研究科, 非常勤研究員 (10534802)

研究分担者 古松 毅之  岡山大学, 大学病院, 講師 (20432651)
西田 圭一郎  岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (80284058)
廣畑 聡  岡山大学, 保健学研究科, 教授 (90332791)
品岡 玲  岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (90724500)
研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
キーワードマトリックス / miRNA / エクソソーム / アグリカン / 変形性関節症
研究実績の概要

今までの我々の研究によりメカニカルストレスにより軟骨細胞においてマトリックス分解酵素の発現抑制が誘導出来ること、また適度なメカニカルストレスを与えることでマトリックス成分の発現誘導を行えることを見出している。これらのことを踏まえ軟骨様細胞株OUMS-27に対し種々のメカニカルストレスを負荷、細胞からmicroRNAを回収し、microRNAアレイ解析を行った。メカニカルストレス負荷によりその発現が上昇しtargetScan、PITA、DIANAなど複数のアルゴリズムを用いてそのターゲットがADADMTS、MMPなどのマトリックス成分分解関連因子である可能性の高いmiRNAを複数選択した。
これら候補miRNAに対し、それぞれの配列特異的阻害剤を細胞に添加しmiRNAターゲット遺伝子の経時的発現変化をタンパクレベルで解析した。複数のmiRNAにおいて標的タンパクの発現上昇を確認した。またメカニカルストレスを添加することにより標的タンパクの発現上昇がみられた。
軟骨細胞OUMS-27に対しメカニカルストレスを負荷し培養上清中に産生されるエクソソームを超遠心法、カラム法で回収し比較した。超遠心法は収量が少なく、逆に行程数、時間も多い為カラム法で今後は回収することとした。メカニカルストレスの個体レベルの解析としてラットOAモデルのトレッドミルによる走行負荷試験を行った、現時点では十分な個体数になっておらず統計的有意な差ではないが適度な走行負荷条件では軟骨の損傷抑制傾向がみられた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

軟骨様細胞株OUMS-27でメカニカルストレスにより変動するmiRNAでありそのターゲットがマトリックス成分関連因子であるmiRNAを見いだした。更にmiRNAの配列特異的阻害剤を細胞に添加しmiRNAターゲット遺伝子の発現変化をタンパクレベルで抑制した。ある条件下で変動するmiRNAを見出すのは比較的容易であるがそのmiRNAが制御する遺伝子を見出すことは非常に困難であることが多い。今年度標的タンパクまで解析できたことは大きな進展であると考えている。また、マトリックス成分制御miRNA候補も検出できている。
軟骨細胞OUMS-27に対しメカニカルストレスを負荷し培養上清中に産生されるエクソソームの調製方法の検討を終えた。メカニカルストレスの個体レベルでの解析を行い、試験数は少ないながらも今後の方針決定を行うに足る結果を得ている。

今後の研究の推進方策

今回見いだしたmiRNAの発現ベクターを軟骨細胞に導入、過剰発現を行い標的遺伝子産物の変化をmRNA、タンパクレベルで確認する。またアグリカン、ADAMTS、MMP特異的アグリカン分解断端を検出することにより軟骨破壊作用との関連性についても解析していく予定。ラットOAモデルにおいて経時的に滑液、さらにエクソソームを回収、miRNAを精製しin vitroにおいて見出したmiRNAの変動を調べる。個体レベルの検討においては試験数を増やし検討していく予定である。

次年度使用額が生じた理由

消耗品購入に充てる予定であったが統括者の購入品をシェアしたため本年度は必要なかった。

次年度使用額の使用計画

本年度消耗品等に充当する。

  • 研究成果

    (4件)

すべて 2017 2016

すべて 学会発表 (4件) (うち国際学会 1件)

  • [学会発表] HYBID (HYaluronan-Binding protein Involved in hyaluronan Depolymerization) 遺伝子の炎症性サイトカインによる発現機構解析2017

    • 著者名/発表者名
      大月孝志、吉田浩之、品岡玲、熊岸-品岡加苗、メフメット・ゼイネル・チレッキ、オメル・ファルク・ハティポール、稲垣純子、西田圭一郎、岡田保典 、廣畑聡 "
    • 学会等名
      第30回日本軟骨代謝学会
    • 発表場所
      京都
    • 年月日
      2017-03-03 – 2017-03-04
  • [学会発表] Expression and proteolysis of the proteoglycan versican in the tumor microenvironment2016

    • 著者名/発表者名
      Keiichi Asano, Tyler Alban, Courtney Nelson, Junko Inagaki, Takashi Ohtsuki, Shozo Kusachi, Yoshifumi Ninomiya, Toshitaka Oohashi, Suneel Apte, Satoshi Hirohata
    • 学会等名
      American Society for Matrix Biology Biennial Meeting 2016
    • 発表場所
      Florida, USA
    • 年月日
      2016-11-13 – 2016-11-16
    • 国際学会
  • [学会発表] 変形性膝関節症の治療効果に関する組織学的解析-ラットモデルを用いての検討-2016

    • 著者名/発表者名
      熊岸-品岡 加苗、大月孝志、廣畑聡、河村顕治、大塚愛二 、坂田賢一郎、坂田俊輔
    • 学会等名
      第29回日本臨床整形外科学会学術集会
    • 発表場所
      札幌
    • 年月日
      2016-08-31 – 2016-09-02
  • [学会発表] 変形性関節症へのヒアルロン酸投与、いつ投与すべきか?~動物モデルからの知見~2016

    • 著者名/発表者名
      大月孝志、品岡玲、熊岸加苗、河野真優美、篠原真歩、浅野恵一、稲垣純子、大橋俊孝、西田圭一郎、廣畑聡
    • 学会等名
      第48回日本結合組織学会学術大会
    • 発表場所
      長崎
    • 年月日
      2016-06-24 – 2016-06-25

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公開日: 2018-01-16  

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