2018 年度実施状況報告書

新規ドセタキセル結合タンパクの前立腺癌におけるタキサン系抗癌剤耐性獲得機序の解明

研究課題

研究課題/領域番号	16K11032
研究機関	明治国際医療大学
研究代表者	高羽夏樹明治国際医療大学, 医学教育研究センター, 准教授 (80294081)
研究分担者	納谷佳男明治国際医療大学, 医学教育研究センター, 客員教授 (80639881) 浮村理京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (70275220) 上田紗弥 (伊藤紗弥) 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (90534511) 本郷文弥京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80291798) 藤原敦子京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (20457980) 邵仁哲京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 客員教授 (40305587) 上田崇京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 客員講師 (50601598) 大石正勝京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 客員講師 (90405316)
研究期間 (年度)	2016-04-01 – 2020-03-31
キーワード	前立腺癌 / 抗癌剤耐性 / タキサン / ドセタキセル / ケミカルバイオロジー
研究実績の概要	本研究では、先行研究（平成24年-26年度科研費　基盤研究(C) 課題番号:24592405）で我々がケミカルバイオロジーの手法を用いて同定したドセタキセル結合タンパクの前立腺癌における抗癌剤耐性獲得機序の分子生物学的解明を試みる。先行研究で用いた、アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞株DU145の親株（ドセタキセル感受性株）と、親株から確立した２種類のドセタキセル耐性株を用いる。先行研究において、ドセタキセル結合タンパクとして同定したbasonuclin 1 (BNC1)のmRNA発現量はドセタキセル耐性株において感受性株の約20％に低下していることを明らかにしている。一昨年度の研究では、BNC1特異的siRNAの処理でドセタキセル感受性株におけるBNC1の発現を低下させた状態で、種々の濃度のドセタキセルを添加し細胞増殖アッセイを行ったところ、control siRNAで処理した場合に比べ、高濃度ドセタキセル存在下での細胞増殖が高く、BNC1の発現低下がドセタキセル抵抗性獲得に関与することが示唆された。昨年度は上記の実験の至適条件を決め再現性を確認すべく、色々な条件で実験を重ねたが、実験結果の再現性が得られなかった。このため、当初の予定を変更し、BNC1発現抑制による遺伝子発現変化を網羅的に解析し、その中からドセタキセル感受性に関わるもしくは癌の進展に関わる遺伝子を同定することを考え、DU145をcontrol siRNAおよびBNC1特異的siRNAで処理した後にcDNA microarrayを行った。また、BNC1が転写因子であり、かつドセタキセル結合タンパクであることより、同様の処理をドセタキセル存在下にも行い4つの条件でcDNA microarrayを行った。現在、これらの結果の解析を行っている。cDNA microarrayは、当初は平成30年度に行う予定であった。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 4: 遅れている理由 Basonuclin 1(BNC1)がドセタキセル耐性株で発現低下していることを先行研究で示したが、現行研究ではBNC1の発現抑制実験でドセタキセル感受性低下との相関を示せなかったため、計画を変更しcontrol siRNAおよびBNC1特異的siRNAで処理後にcDNA microarrayを行った。また、BNC1が転写因子であり、かつドセタキセル結合タンパクであることより、同様の処理をドセタキセル存在下にも行い4つの条件でcDNA microarrayを行った。発現変動する遺伝子が予想以上に多く結果解析が難渋し、候補遺伝子が絞れず研究を進められなかった。
今後の研究の推進方策	cDNA microarrayの結果より、BNC1発現低下に伴い遺伝子発現が変化する遺伝子の中から、ドセタキセル感受性に関与する候補を選定する。選定された遺伝子の発現をDU145ドセタキセル感受性株およびDU145ドセタキセル耐性株で確認し、ドセタキセル感受性と関与する可能性があれば、当該遺伝子をsiRNAで発現抑制した後にドセタキセル存在下の細胞増殖アッセイでドセタキセル抵抗性獲得に関連するかを判断する。上記の如く解析された遺伝子の発現変化がドセタキセル存在下でさらに同様の方向へ変化することがcDNA microarrayの結果で確認された場合は、zinc finger proteinであるBNC1が転写因子として当該遺伝子の発現を制御しており、さらにその転写活性がドセタキセルのBNC結合により調節されていることが推測される。これらを確かめるために、当該遺伝子のプロモーターを用いたCAT assayを行う。ドセタキセル存在下に転写活性が変化するかを評価することで、ドセタキセル結合によるBNC1転写活性能への影響を評価する。 BNC1とは別に、我々がドセタキセル結合タンパクとして精製・同定した40S-ribosomal protein S18および16S- ribosomal proteinのDU145ドセタキセル感受性株および耐性株における発現を定量RT-PCRで比較し、ドセタキセル感受性との関連が示唆された場合は、siRNAによる発現抑制を行ったうえで細胞増殖アッセイを行いドセタキセル感受性への影響を評価する。上記の検討よりドセタキセル感受性調節タンパクであることが確かめられた場合は、前立腺生検標本、手術検体を用いて免疫組織染色を行い、ドセタキセルによる治療効果（腫瘍縮小効果、PSA 反応性、奏効期間）との相関について解析を行い、治療効果予測因子としての有用性を評価する。
次年度使用額が生じた理由	Basonuclin 1(BNC1)がドセタキセル耐性株で発現低下していることを先行研究で示したが、現行研究ではBNC1の発現抑制実験でドセタキセル感受性低下との相関を示せなかったため、計画を変更しcontrol siRNAおよびBNC1特異的siRNAで処理後にcDNA microarrayを行ったが、発現変動する遺伝子が予想以上に多く結果解析が難渋し、候補遺伝子が絞れず研究を進められなかったため、次年度使用額が生じた。 cDNA microarrayの結果から選定されたドセタキセル感受性調整タンパクの候補遺伝子をsiRNAにより発現抑制したうえでのドセタキセル感受性評価、ドセタキセル感受性調整に関連することが確認された遺伝子のプロモーターを用いたCAT assay、臨床検体におけるドセタキセル感受性調整タンパクの発現の免疫組織染色による検討に必要な試薬、siRNA、抗体、免疫組織染色用キット、細胞培養液、消耗品（培養用プラスチック製品など）の費用として物品費645,015円を、学会・論文発表の費用（印刷費、学会参加費など）としてその他100,000円を予定している。