| 研究課題/領域番号 |
16K11056
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
柴田 泰宏 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 助教 (10534745)
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| 研究分担者 |
鵜川 眞也 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (20326135)
佐々木 昌一 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 研究員 (50225869)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | acid sensing ion channel / 機械刺激受容体 / 膀胱 |
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| 研究実績の概要 |
尿意切迫感を伴う病態として、過活動膀胱（overactive bladder; OAB）の概念が広く認知されるようになった。高齢化が加速する近年、下部尿路症状を呈する患者は更に増加することが予想される。また、頻尿や尿意切迫感はQOLや社会的活動度を著しく低下させるため、健康長寿に向けてOABへの対策の重要性が叫ばれている。近年、抗コリン薬に加えてβ3刺激約が臨床応用されるなど治療法が多様化しているが、全ての人の愁訴を取り除くには至っていない。
切迫性の尿意は、排尿筋過活動(deatrusor overactivity)による急な膀胱の収縮の結果と、膀胱の知覚そのものの過敏とに理屈の上で分類できる。しかし、現在OABに対して臨床応用されている薬物は、いずれも遠心性神経/排尿筋接合部が主たる治療標的である。このため、尿意発生の根本の理解と、膀胱の求心性神経を治療標的とした薬剤の開発が求められている。
これまでにも、TRPV4やPiezo1/Piezo2など複数の機械刺激受容体候補が膀胱で研究されてきた。しかし、尿意の発生をつかさどる分子は未確定というのが一般的な見解である。
私たちはこれまで機械刺激受容体候補遺伝子であるASIC（Acid Sensing Ion Channel）ファミリーを中心に解析を行ってきた。しかし、ASICファミリーはヘテロ複合体を形成しており、サブユニット単体のノックアウトマウスでは機能解析が困難であった。私たちは今回、膀胱に発現しているASICサブタイプ（ASIC1/2/3/4）の全てをノックアウトしたクワドラプル（４重）ノックアウトマウスおよび各種ノックインマウスを作製することで、膀胱機能、特に伸展刺激受容におけるASICファミリーの役割を解明することを目的とする。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究では、酸感受性イオンチャネル（ASIC）遺伝子ファミリーのサブユニットがマウスの膀胱で機械刺激受容機能に関与している可能性を包括的に探るため、遺伝子改変動物を用いた形態学的、機能的解析を計画している。これまでに当教室で作出し管理しているASIC1、ASIC3、ASIC4ノックアウトマウスを交配し、現在までにトリプルノックアウトマウスを得た。現在、ASIC2ノックアウトマウスの入手について手続きを進めている段階であり、入手後に交配を開始する予定である。
これまでに、ASIC4の局在を明らかにするためにASIC4-βガラクトシダーゼレポーターマウスを用いて膀胱におけるASIC4の局在を検討したところ、膀胱筋層にASIC4陽性細胞が散在することが確認された。βガラクトシダーゼによるレポーター系では、陽性細胞の検出は可能であるが細胞内局在についての情報を得ることはできない。そこで、免疫組織化学染色法によるASIC4の細胞内局在の検討を試みた。様々な市販の抗体を購入し、ウエスタンブロットによる特異度の検討、染色時における各種の条件の検討を行ったが、ASIC4を検出するために高感度、高特異度の抗体を市販抗体の中に見いだすことはできなかった。このため、後述のようにASIC4-標識分子融合ノックインマウスを作出する必要があると考えられ、この作出のためのベクター作製に時間を要し、全体の進捗はやや遅れていると考えられた。
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| 今後の研究の推進方策 |
前述のように、ASICの各サブユニットに高感度、高特異度の抗体を市販抗体の中に見いだすことはできなかった。ASICファミリーの各サブユニット分子の局在および形態学的な情報は機能への重要な手がかりとなることから、市販抗体を利用する以外の方法でASICファミリー分子の検出を行うことが必要となった。方法として、抗原エピトープを自分で設計し、ポリクローナル抗体を自作するか、ASICファミリー分子標識ノックインマウスを作出することが考えられた。膜タンパク質は一般的に抗体での標識が困難である場合があることから、ASICファミリー分子標識ノックインマウスの作出を行うこととした。前述のノックアウトマウスの交配と平行して、現在、遺伝子工学的にASICとタグ分子を融合させたタグ融合ASICを発現するノックインマウスを作出する計画を進行中である。遺伝子改変動物を得るためには通常半年から１年を要するが、本研究期間内になるべく早期に動物を得るため、当大学内の実験動物研究教育センターの協力の下、CRISPR/Cas9システムを用いた遺伝子組み換え手法を用いて、前核期受精卵へ直接CRISPR/Cas9ベクターをマイクロインジェクションし、発生の確認できた胚を卵管移植する方法を検討中である。現在までにgRNAの候補配列を決定し、そのうち最も効果的であると予測されるものをベクターに組み込み、切断活性を確認した段階である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度に行った実験の結果、市販抗体の中に効果的にASIC4を高感度、高特異度に認識する抗体を見いだすことができなかった。ASICファミリーの各サブユニット分子の局在および形態学的な情報は機能への重要な手がかりとなることから、市販抗体を利用する以外の方法でASICファミリー分子の検出を行うことが必要となった。膜タンパク質は一般的に抗体での標識が困難である場合があることから、今後の汎用性を考慮してASICファミリー分子標識ノックインマウスの作出を行うこととした。
現時点までにノックインマウス作出のための準備としてターゲティングベクターの設計および作製、また、遺伝子改変に必要なCRISPR/Cas9ベクターの作製に時間を要し、予定の支出が次年度に繰り越される結果となった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
前述の遺伝子改変動物作製の準備は順調に進んでおり、次年度に動物作出のために繰越金額を使用する予定である。具体的には、ベクター精製のための分子生物学的操作に必要な試薬やキット類の購入費、採卵用マウスや借り腹用マウス、受精のためのオスマウス、偽妊娠状態の作製に必要な卵管結紮オスマウス用のマウスなどの動物購入費、動物飼育費、ベクターを受精卵にマイクロインジェクションする際に必要なガラス管や培地、シャーレなどの購入費として使用することを予定している。
また、動物作出が順調に進んだ場合には標識タグ分子用の抗体各種を使用予定であり、これらを購入する予定である。
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