| 研究課題/領域番号 |
16K11056
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
柴田 泰宏 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10534745)
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| 研究分担者 |
鵜川 眞也 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (20326135)
佐々木 昌一 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 研究員 (50225869)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 過活動膀胱 / acid sensing ion channel / 知覚神経 / 機械刺激受容体 |
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| 研究実績の概要 |
尿意切迫感を伴う病態として、過活動膀胱(overactive bladder; OAB)の概念が広く認知されるようになった。高齢化が加速する近年、下部尿路症状を呈する患者は更に増加することが予想される。また、頻尿や尿意切迫感はQOLや社会的活動度を著しく低下させるため、健康長寿に向けてOABへの対策の重要性が叫ばれている。近年、抗コリン薬に加えてβ3刺激約が臨床応用されるなど治療法が多様化しているが、全ての人の愁訴を取り除くには至っていない。
切迫性の尿意は、排尿筋過活動(detrusor overactivity)による急な膀胱の収縮の結果と、膀胱の知覚そのものの過敏とに理屈の上で分類できる。しかし、現在OABに対して臨床応用されている薬物は、いずれも遠心性神経/排尿筋接合部が主たる治療標的である。このため、まずは尿意発生の根本のメカニズムを理解し、それに基づいた治療戦略が必要であると考える。
私たちはこれまでに機械刺激受容体候補遺伝子であるASIC(Acid Sensing Ion Channel)ファミリーを中心に解析を行ってきた。しかし、ASICファミリーはヘテロ複合体を形成しており、サブユニット単体のノックアウトマウスでは機能解析が困難であった。私たちは今回、膀胱に発現しているASICサブタイプ(ASIC1/2/3/4)の全てをノックアウトしたクワドラプル(4重)ノックアウトマウスおよび各種ノックインマウスを作製することで、膀胱機能、特に伸展刺激受容におけるASICファミリーの役割を解明することを目的として解析を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究では、酸感受性イオンチャネル(ASIC)遺伝子ファミリーのサブユニットがマウスの膀胱で機械刺激受容機能に関与している可能性を包括的に探るため、遺伝子改変動物を用いた形態学的、機能的解析を計画している。これまでに当教室で作出し管理している ASIC1、ASIC3、ASIC4ノックアウトマウスを交配し、現在までにトリプルノックアウトマウスを得た。現在、ASIC2ノックアウトマウス の入手について手続きを進めている段階であり、入手後に交配を開始する予定である。 これまでに、ASIC4の局在を明らかにするためにASIC4-βガラクトシダーゼレポーターマウスを用いて膀胱におけるASIC4の局在を検討したところ、膀胱筋層にASIC4陽性細胞が散在することが確認された。βガラクトシダーゼによるレポーター系では、陽性細胞の検 出は可能であるが細胞内局在についての情報を得ることはできない。そこで、免疫組織化学染色法によるASIC4の細胞内局在の検討を試みた。様々な市販の抗体を購入し、ウエスタンブロットによる特異度の検討、染色時における各種の条件の検討を行ったが、ASIC4 を検出するために高感度、高特異度の抗体を市販抗体の中に見いだすことはできなかったため、ASIC4-タグペプチド融合タンパクノックインマウスの作出を試み、現在F1世代が得られた状態である。
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| 今後の研究の推進方策 |
前述のように、現在ASIC4-タグ分子融合タンパク質ノックインマウスのF1世代が得られたところである。このマウスについて３’アームおよび５’アーム方向それぞれへのlong PCRによる評価およびsequence解析はすでに行われているが、さらに評価に耐えうる状態にまでバッククロスを行うとともにsouthern blottingなどの評価を行う必要がある。これらの評価ののちに膀胱におけるASIC4の局在について検討を行う予定である。また、ASIC4について、アフリカツメガエルの卵母細胞を用いた発現系を使った２電極膜電位固定法による電気生理学的解析を行ったところ、浸透圧変化が電流に影響をあたえる可能性が示唆された。これはASICファミリーが物理的な刺激に応答する可能性を示唆するものであり、今後さらなる解析を行っていく予定である。さらに、本来であれば本年度に行う予定であったASIC2ノックアウトマウスの当大学動物施設への搬入についての計画を推進し、次年度早期にASICファミリークワドラプルノックアウトマウスの作出を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前年度までに行った実験の結果、市販抗体の中に効果的にASIC4を高感度、高特異度に認識する抗体を見いだすことができなかった。ASI Cファミリーの各サブユニット分子の局在および形態学的な情報は機能への重要な手がかりとなることから、市販抗体を利用する以外 の方法でASICファミリー分子の検出を行うことが必要となった。このため、ASIC4-タグペプチド融合タンパク質ノックインマウスを作出することを計画し、本学の実験動物研究教育センターとともに動物の作出を行うこととした。結果として、ターゲティングベクターの作成やCRISPR/Cas9ベクターの遺伝子編集効率のチェックなど、動物の作出以前の段階で多くの時間を割くこととなったため、次年度使用が生ずることとなった。次年度使用の計画としては、得られたノックイン動物の飼育、評価および実験への使用や、今後の研究の推進方策で記載した内容を実現するために使用する。また、ASIC２ノックアウトマウスの搬入、ASICファミリークワドラプルノックアウトマウスの作出のための動物の交配および維持に関わる経費と、クワドラプルノックアウトマウスを用いた各種実験のための経費として用いる予定である。
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