| 研究課題/領域番号 |
16K11096
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| 研究機関 | 大分大学 |
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研究代表者 |
西田 欣広 大分大学, 医学部, 准教授 (10336274)
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| 研究分担者 |
花田 俊勝 大分大学, 医学部, 教授 (10363350)
酒井 久美子 大分大学, 医学部, 助教 (60225753)
花田 克浩 大分大学, 医学部, 助教 (90581009)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 妊娠高血圧症候群 / メタボローム解析 / 臍帯静脈血管内皮細胞 / 胎盤絨毛細胞 |
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| 研究実績の概要 |
妊娠高血圧症候群（HDP）の胎盤オートファジーのメカニズムを解明するため、特にシャペロンが介在している系を重点的に明らかにし、その一次代謝物をメタボローム解析する。まずヒト胎盤よりシャペロン関連タンパクの発現を生化学的手法、免疫組織学的手法を用いて解析する。また臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC）、胎盤絨毛細胞の初代培養系を確立したのち低酸素、低栄養状態におけるオートファジーをモデル化する。また細胞免疫組織学的にシャペロンの免疫染色を行い、細胞内での発現の推移と低酸素、低栄養の与える影響について検討する。また同時にHDP胎盤および正常胎盤よりmRNAを抽出し、mRNAのマイクロアレイ解析を行い、オートファジーにおけるmRNAの変動遺伝子の同定と胎盤組織の一次代謝物を網羅的にメタボローム解析したものと比較、統計解析を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成28年度から29年度にかけおよそ80％ほどの実験は終了しているが、その後昨年より、実験補助の大学院生の産休および講座技官の削減(2名から1名へ）のため今後の実験計画微修正が必要と考えられている。現在当初予定の項目は以下の8段階である。
①HDP妊婦および正常妊婦よりそれぞれ得られる胎盤を週数、重症度、時期(EO/LO)による影響をマッチさせ、各10症例ずつサンプル調整を行う。②得られた胎盤を速やかにRNase処理し、mRNAを抽出し、mRNAのマイクロアレイ様にストックし、すべてのmRNAが揃った段階で解析を行う（外部委託研究）。③また、同時に得られた胎盤組織をホモジナイズし、LIPA buffer等を用いてタンパクを抽出後、western blotting用に調整する。④組織の一部は電顕用に固定し、細胞のオートファゴソームの動態を観察する。⑤タンパク調整が終了した段階で適宜、オートファジー関連タンパクのwestern blottingを行い、発現を確認する。⑥培養細胞研究としてHUVECを用いて、低酸素、低栄養下でのオートファジー誘導実験を行う。低酸素はすでに研究代表者の研究室に設置している酸素濃度可変チャンバーにより酸素濃度を変動させる、もしくはH2O2による低酸素状況下に行う。すでに低酸素下の確認は予備実験でHIF-1αとVEGFの誘導をマーカーとして使用できることを確認している。⑦胎盤組織およびヒト血清のメタボローム解析を行うにあたり、至適条件の決定を行う。統計解析は多変量解析（SIMCA）、PLS判別分析（OPLS-DA）法を用いる。⑧HUVECにおいて各種ストレス条件下（低酸素、低栄養）に網羅的にメタボローム解析を行い、予知可能な代謝物の抽出を行う。これらの計画は予定の再現性の確認以外はほぼ終了している。次の項で今後の対策を述べる。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度より共同実験者である大学院生が産休に入り、講座付技官も2人から1人になったため、実験の遂行が遅れている。当初今年度はマウスによる詳細な分子解析を予定していたが、マンパワーの低下により実験室内で1人で遂行可能な胎盤のメタボローム解析と新たに樹立した胎盤絨毛細胞(初代培養系）を用いた低酸素条件を中心とした各種刺激実験に研究計画の修正を行う。すでにmRNAアレイ解析で変動があると思われる主要関連因子をqPCRにてその変動を確認、解析する。すでにパイロット実験により、オートファジー関連のSIRT1-NFRG1システムの新たな系の変動を見出しており、これに私が得意とするメタボローム解析を組み合わせた新たな解析法にてまとめて論文化する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
共同実験者の大学院生が産休となったこと、および講座実験補助者の削減により実験日の減少のため試薬が予定より少なかった。またもともと購入予定の試薬も業者との調整で効率的に購入でき節約したため。次年度は大学院生も産休から復帰見込みのため物品購入も予定に従い使用できる見込みである。
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