| 研究課題/領域番号 |
16K11111
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
吉武 洋 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 非常勤講師 (00396574)
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| 研究分担者 |
荒木 慶彦 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 先任准教授 (70250933)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 抗精子抗体 / α-N-アセチルグルコサミニダーゼ / バイセクト型糖鎖 |
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| 研究実績の概要 |
以前我々の研究グループが樹立した自己抗体由来の抗マウス精子単クローン抗体Ts4は、バイセクト型N-アセチルグルコサミン(bisecting GlcNAc)構造を有するフコシル化二本鎖複合型糖鎖への結合を介して複数の糖タンパク質を認識している。本抗体はマウス成熟精子以外に精巣内の精母細胞・精子細胞及び初期胚に反応し、精巣内では生殖細胞マーカー糖タンパク質TEX101が本抗体の認識分子の一つであることが明らかとなっている。本研究では成熟精子におけるTs4の対抗抗原の同定を免疫沈降法及び高速液体クロマトグラフィー/質量分析法を用いて行った。その結果、本抗体対応抗原の一つとしてα-N-acetylglucosaminidase (Naglu)が同定された。本分子はヘパラン硫酸分解酵素活性を持ち、ヒトでは本分子欠損によりムコ多糖症IIIB型が発症することが知られているが、生殖過程における生物機能については不明であった。そこで成熟精子におけるNagluの性状解析を行った。成熟精子において本分子は形態学的には精子頭部及び鞭毛に存在していた。また生化学的には82kDaと77kDaの二つのタイプが存在していた。Ts4はこのうち82kDaのNagluにのみ反応し、このタイプは頭部にのみ発現していた。さらにTs4は体外受精成功率を低下させ、かつヘパラン硫酸により誘導される先体反応を阻害する効果を有していた。以上の結果より、Ts4が認識するbisecting GlcNAc構造を有するフコシル化二本鎖複合型糖鎖と、本糖鎖が修飾されているNagluは受精過程において生理活性を有する可能性がある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成28年度の研究目的は、精巣・精巣上体精子におけるTs4反応性バイセクト型糖鎖を有する糖タンパク質の同定であり、その方法として免疫沈降法により対応抗原を抽出し、高速液体クロマトグラフィー/質量分析法を用いることとした。当初の計画通り、この方法で精巣上体精子におけるTs4認識分子を同定することが可能であった。さらに同定した分子の生化学的性状や生殖過程への関与の可能性を明らかにすることができたため、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
Ts4反応性バイセクト型糖鎖を有する糖タンパク質は、今回同定された分子以外にも複数存在する。引き続き未知の糖タンパク質についても同じ方法で解析を進める予定である。
さらに新たに同定されたタンパク質をコードする遺伝子を培養細胞株に導入し、Ts4対応抗原発現細胞株を作製する。次に遺伝子導入したタンパク質にTs4反応性バイセクト型糖鎖が修飾されていることを確認する。修飾されている場合には、本糖鎖構造をペプチドに付加するN-アセチルグルコサミン転移酵素III (GnT-III)に対するsiRNAを導入し、バイセクト型糖鎖合成を阻害したときの細胞動態を観察する。遺伝子導入による発現タンパク質にバイセクト型糖鎖が付加されていない場合には、GnT-III遺伝子が高発現している細胞株を選別し使用するか、あるいはGnT-III遺伝子を導入してその細胞株を実験に供する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
複数存在すると考えられるTs4対応抗原の中で、今回同定された１種類の糖タンパク質のみの分子性状解析を優先したため、費用が最もかさむ他の糖タンパク質同定のための免疫沈降法及び高速液体クロマトグラフィー/質量分析法を予定回数行わなかったため、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
未知のTs4対応抗原同定のための免疫沈降法及び高速液体クロマトグラフィー/質量分析法に使用する計画である。
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