| 研究課題/領域番号 |
16K11203
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| 研究機関 | 産業医科大学 |
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研究代表者 |
鈴木 秀明 産業医科大学, 医学部, 教授 (20187751)
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| 研究分担者 |
大淵 豊明 産業医科大学, 医学部, 講師 (00412651)
小泉 弘樹 産業医科大学, 医学部, 助教 (70461572)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 中耳粘膜 / 線毛運動 / 制御機構 / ムスカリン受容体 / ATP / Pannexin / Calcium |
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| 研究実績の概要 |
１）中耳手術時に採取した中耳粘膜を酸素でbubblingしたHank's balanced salt solution (HBSS)に浸した。粘膜を細い帯状に細切し、観察用チャンバーに移して位相差顕微鏡下に線毛運動を観察した。線毛運動は顕微鏡に接続した高速度デジタルビデオカメラHAS-U1 (DITECT、東京）で録画し、付属のソフトウェアHAS-U1U2で解析した。実験は室温で行い、録画速度は毎秒200コマとした。
Baselineの線毛運動速度は6～10 Hzで、Caイオン(-)の溶液中では抑制された。線毛運動速度はacetylcholineやATPによって促進され、この促進効果はmuscarine受容体拮抗薬、pannexin channel拮抗薬、P2Xプリン受容体拮抗薬で阻害された。
２）中耳手術時に採取した中耳粘膜を一定の直径の円形にpunch outし、HBSSが入ったチャンバーに留置した。そして各種薬剤で10分間刺激し、ATPの放出量をluciferin-luciferase assayにより測定した。ATPは無刺激の状態でも少量産生され、Caイオン(-)の溶液中では抑制された。このATP産生はacetylcholineによって促進され、この促進効果はmuscarine受容体拮抗薬、pannexin channel拮抗薬、P2Xプリン受容体拮抗薬で阻害された。
３）以上より線毛運動の変化と一致してATP放出量が増減することがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初予定した、初年度の高速度デジタルビデオカメラによる線毛運動の観察、luciferin-luciferase assayによるATP放出量の測定はほぼ予定通り進んでいると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）平成28年度に引き続き、手術時に採取した中耳粘膜を用いて高速度デジタルビデオカメラによる線毛運動の観察とluciferin-luciferase assayによるATP放出量の測定を行い、再現性を確認する。
２）採取した中耳粘膜をparaformaldehydeで固定し、muscarine受容体（subtype 1-5）、pannexin channel (subtype 1-3)、P2Xプリン受容体の発現・局在を蛍光免疫組織染色法で調べる。
３）さらに中耳粘膜をTRIzol溶液に浸し、acid guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform法によりRNAを抽出する。抽出したRNAを定量的RT-PCRで分析し、muscarine受容体（subtype 1-5）、pannexin channel (subtype 1-3)、P2Xプリン受容体のmRNAの発現を調べる。内部標準遺伝子としてはGAPDHを用いる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
DITECT社の一連の高速度デジタルビデオカメラの性能が全般的に向上し刷新された。このため、旧製品のHAS-L2と同等の性能の新機種（HAS-U1）を予定よりも安価で購入することができた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
試薬類の購入、文献入手にかかる経費、高速度デジタルビデオカメラの保守・点検にかかる経費、学会・研究会出席の旅費等に使用する予定である。
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