| 研究課題/領域番号 |
16K11288
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
三田村 佳典 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学系), 教授 (30287536)
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| 研究分担者 |
仙波 賢太郎 徳島大学, 病院, 助教 (10745748)
江川 麻理子 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学系), 講師 (70507657)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 外科 / 細胞・組織 / 生体分子 / 糖尿病 / 臨床 |
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| 研究実績の概要 |
我々は腫瘍増殖などに伴う異常な血管新生や脈絡膜血管新生に関与しているPPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma)が糖尿病網膜症の進行にも関与していることを報告した。また、2015年のNature誌にサイクリン依存性キナーゼ5(Cdk5: Cyclin-dependent kinase 5)がPPARγの糖尿病誘発作用を促進することが発表され、糖尿病網膜症の進行においてもPPARγがCdk5の制御を受けている可能性が予想される。今回、硝子体手術で得られる増殖膜と硝子体液を用いてCdk5活性を検索し、増殖糖尿病網膜症においてCdk5の異常な活性化がないか、PPARγ濃度との相関がないかを確認するため本研究を施行した。さらに、ラットの培養グリア細胞やヒト血管内皮細胞をAGEや高濃度のグルコース下で培養することによって、Cdk5の異常な活性化をもたらすかどうかを検索する予定である。
硝子体手術時に得られた検体を解析するに当たっては、倫理委員会での承認を得たうえで、対象患者からは充分なインフォームドコンセントを得た。黄斑円孔・黄斑上膜（新生血管を含まないコントロール）、増殖糖尿病網膜症の手術時に灌流液を流す前に前房水・硝子体を吸引した後、直ちに-80℃にて保存した。また、黄斑上膜、増殖糖尿病網膜症の増殖膜検体を採取し、免疫染色用検体については直ちにOCT compoundに包埋し凍結させた後、-80℃にて保存した。今後、十分なサンプル数が確保できてから順次、解析を行ってゆく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１）増殖糖尿病網膜症とコントロールとして血管新生を伴わない特発性黄斑円孔・黄斑上膜の硝子体手術時に眼内還流を行う前の段階で前房水・硝子体のサンプルをそれぞれ３８検体、４３検体、人工房水で希釈されないように採取して-80°で保存した。１００検体を超えた段階で解析を開始する予定である。
２）黄斑上膜（新生血管を含まないコントロール）、増殖糖尿病網膜症の増殖膜検体５検体を採取し、免疫染色用検体については直ちにOCT compoundに包埋し凍結させた後、-80℃にて保存した。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）平成２８年度に引き続き前房水・硝子体検体の採取を進める。硝子体手術中に灌流液を流す前に前房水・硝子体を吸引した後、直ちに-80℃にて保存する。
２）平成２８年度に引き続き黄斑上膜（新生血管を含まないコントロール）、増殖糖尿病網膜症の増殖膜検体を採取し、免疫染色用検体については直ちにOCT compoundに包埋し凍結させた後、-80℃にて保存する。
３）増殖膜および特発性黄斑上膜の網膜前膜（新生血管を含まないコントロール）のヒト手術検体からRNAを抽出した後cDNAを合成する。Cdk 5およびCdk 5の制御因子であるp35に特異的なプライマーを用いた定量的PCR法により、両群におけるCdk 5、p35遺伝子発現量を比較検討する。Cdk 5、p35、p20（p35の分解産物）タンパク質の発現量についてもWestern blotting法により確認する。また同検体から得られた同量の細胞質画分の蛋白質を，抗Cdk5抗体で免疫沈降したのち，ヒストンHlと反応させ，ヒストンH1のリン酸化により蛋白質量あたりのCdk5活性を検索する。PPARγや、VEGFなど血管新生に関与するサイトカインの発現量変化についてもWestern blotting法を用いて調べる。一方、両群のヒト手術検体から凍結切片を作成し、蛋白レベルでの発現パターンについてCdk5抗体を用いた免疫染色法により比較する。さらに、血管内皮細胞などの特異抗体との免疫二重染色を行い、増殖糖尿病網膜症の増殖膜におけるCdk5の局在について検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
物品費で購入した物品が想定より安く購入できたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
翌年度の試薬の購入に充当する。
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