| 研究実績の概要 |
＜平成２９年度：網膜色素変性症患者iPS細胞ノックインライン樹立＞
本研究では，これまでに既に作製された網膜色素変性症（RP）患者由来iPS細胞（RP1，RP9，PRPH2，RHO：Jin ZB et al., 2011；RHO#5, RHOmut-induced: Yoshida T et al., 2014）を使用する．昨年度，理化学研究所バイオリソースセンターに供与申請行い，慶應義塾大学の倫理委員会の承認後に入手することができた．
得られたRPのiPS細胞のライン（59M8（RHO_562G>A変異），K10M5（RP9_410A>T変異），K11PD17（RP9_410A>T変異），K21S4（RP1_2162insC変異），K31M28（RHO_520G>A変異, PRPF31_613_615delTAC変異），RHO#5（RHO_541G>A変異, RHOmut-induced（RHO_541G>A変異）のゲノムを抽出しシークエンスでヘテロの変異を確認した．これらのラインから分化させた桿体視細胞を選択的に標識するために，CRISPR/Cas9システムによるノックイン方法を行った．この方法では，ヒトゲノム上のSafe harborと言われるAAVS1サイトに桿体視細胞に特異的なNrl遺伝子のプロモーターGFP発現カセット（Nrlp-GFP）を挿入した．これにより，網膜桿体視細胞に分化した細胞をGFPで標識することができ，その後の遺伝子発現，機能解析を行うことが可能となった．
現在，特にロドプシン（RHO）に変異のある，59M8，K31M28，RHO#5，RHOmut-inducedについて注目して，これらの細胞の維持培養および分化培養を開始している．
また，一方で網膜視細胞全般（Crx遺伝子）と錐体視細胞（Pde6H遺伝子）を標識するゲノム編集をCRISPR/Cas9で行い，分化した視細胞の遺伝子発現解析を定量PCRによって解析を行った．今後得られる，Nrlp-GFPのラインを加えることによって，基準となるコントロールの視細胞の遺伝子発現が解析可能となった．
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