| 研究課題/領域番号 |
16K11310
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
南塲 研一 北海道大学, 大学病院, 講師 (70333599)
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| 研究分担者 |
清野 研一郎 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 教授 (20312845)
北市 伸義 北海道医療大学, 予防医療科学センター, 教授 (40431366)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 実験的自己免疫性ぶどう膜網膜炎 / iPS 細胞 / マクロファージ様免疫抑制性細胞 / iNOS |
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| 研究実績の概要 |
In vitroの実験では、免疫後のマウスリンパ節から抽出したCD4+T細胞、抗原提示細胞（脾臓細胞）、抗原（hIRBP1-20ペプチド）とともにiPS 細胞由来マクロファージ様免疫抑制性細胞（iPS-SCs）を共培養することで抗原特異的なCD4+T細胞の増殖を抑制できるかを検証し、iPS-SCsの炎症抑制効果について調べた。結果、iPS-SCsの細胞数に依存してCD4+T細胞の増殖を抑制することがわかった。さらに、iPS-SCsはiNOSを発現し、NOを産生することによってT細胞の活性化を抑制することがすでに報告されている。本実験でも、培養上清のNO濃度を測定したところ、iPS-SCs細胞数依存的にNO濃度が高値であることがわかった。
次にin vivoの実験ではマウス実験的自己免疫性ぶどう膜網膜炎 (EAU)をiPS-SCsにより抑制できるかどうかを検証した。EAUを作成するために、マウスに免疫を行う1日前に、治療群ではiPS-SCsを腹腔内投与し、無治療群にはPBSを投与した。その後1週間後から3-4日毎に眼底検査を行い、臨床スコアをつけ、炎症の強さを評価した。21日後に眼球摘出を行い、HE染色を行い、組織学的スコアをつけ、炎症の強さを組織学的にも評価した。昨年度は２回にわたり同実験を行ってきたが、今年度行った3回目の実験では、治療群ではiPS-SCsの細胞数は1×10^6個/匹で検討を行ったところ、臨床スコアは13日目 (P = 0.0072)、17日目 (P = 0.01)、21日目 (P = 0.0094)で両群間に有意差が認められた。一方、組織学的スコアではP = 0.49と有意差は認めなかった。今後は、同実験を再度行うとともに、iPS-SCsの細胞数や投与時期の検討も行っていく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
iPS-SCsによるEAU抑制効果が当初予想していたよりも弱いことにより、臨床スコアは有意差が確認されたが組織学的スコアでは有意差が得られていない。iPS-SCsによるEAU抑制メカニズムについて今後検証していく予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまで行ってきた3回のマウスを用いた実験的自己免疫性ぶどう膜網膜炎（EAU）において、臨床スコアではiPS 細胞由来マクロファージ様免疫抑制性細胞（iPS-SCs）投与が有意にぶどう膜炎を抑制していた（1回目は21日目に有意差あり、2回目は有意差なし、３回目は13日目、17日目、21日目で有意差あり）、組織スコアではiPS-SCs非投与群との間に有意差が認められなかった。その原因として、非投与群でのEAUの炎症が弱いことが考えられる。今後はアジュバントを強化することでEAUにおいて惹起される炎症を強くし、再度同じ検討を行う予定である。さらに、適切なiPS-SCsの投与時期、細胞数、投与部位についても検討する。また、In vivoで腹腔内投与されたiPS-SCsがどのような経路をたどって炎症を抑制するのかについて、緑色蛍光タンパク質（GFP）を導入したiPS細胞からSCsを作成してマウスに移植し、iPS-SCsを追跡してみる。もし、追跡できない場合は、発酵酵素であるルシフェラーゼをiPS細胞に導入して、IVIS Imaging System（生体内の目に見えない非常に微弱な発光や蛍光を超高感度冷却CCDカメラで捉え、定量化できる光 in vivo イメージングシステム）を利用して、iPS-SCsを追跡する。
In vitroの実験では、iPS-SCsがCD4+T細胞の増殖を細胞数に依存して抑制することがわかった。今後は、iPS-SCsによる抑制効果が抗原特異的であるかどうか、細胞間接触が必要かどうかを検討するとともに、培養上清におけるIFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-4, IL-10, TGF-β2などの様々な炎症性サイトカイン濃度を計測し、iPS-SCsによる抑制メカニズムについて検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
(理由) iPS-SCsを使ったマウスEAU抑制実験がまとまった期間が必要であり、諸事情により来年度に延期することとなった。その分の培養に掛かる費用、マウスを使った研究に掛かる費用が繰り越しとなった。
(使用計画) 遅延を取り戻すために、速やかに iPS-SCsを使ったマウスEAU抑制実験をおこなう。また、マウスにおけるEAUのiPS-SCsでの抑制について再検証するとともに、iPS-SCsの最適な投与時期についても検証する。
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