| 研究課題/領域番号 |
16K11368
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
木股 敬裕 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (50392345)
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| 研究分担者 |
海野 直樹 浜松医科大学, 医学部, 特任研究員 (20291958)
杉山 成史 岡山大学, 大学病院, 助教 (80379776) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | リンパ浮腫 / 慢性炎症 / 脂肪沈着 / 線維化 |
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| 研究実績の概要 |
倫理委員会の承認を受け、続発性リンパ浮腫患者で手術をうける患者から組織採取の承諾を全例でいただいている。
そのうちの5名に対して、手術施行し計5部箇所からの組織採取を行った。
リンパ浮腫患者から採取した組織は一部を未固定凍結保存、およびパラホルムアルデヒド固定標本を作成した。未固定標本中には術中にリンパ管内に投与したインドシアニングリーンがリンパ浮腫のdermal back flowにより末梢リンパ管内に停滞した状態で保存されており、この分布を特殊な赤外線波長フィルターを使用した顕微鏡で観察解析している。更に、ポドプラニン、prox1、lyve1抗体による免疫組織染色を行い、真皮リンパ管と前述のICGうっ滞分布との位置関係を解析中である。
リンパ浮腫における変化を遺伝子的に検索するため、採取した皮膚組織からRNAを抽出し、リアルタイムPCRにて解析を行った。慢性炎症はIL-6、線維化はコラーゲンTypeⅠ、脂肪沈着はアディポネクチンをターゲット遺伝子と設定し、定量を行った。ハウスキーピング遺伝子としてはGAPDHを用いて標準化定量をおこなったが、ヒト皮膚には発現が不安定であり、それぞれの項目に対して良好なqPCR定量ができなかったが、IL-6に関しては、ある程度の発現を認めている。今後、ハウスキーピング遺伝子をアクチンに変更して定量化できることを確認した後に、正常ヒト皮膚の検体とリンパ浮腫患者の皮膚からの検体での比較を進め、リンパ浮腫状態における慢性炎症などの異常状態を遺伝子レベルで確認できるかどうか検討をすすめる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
リンパ浮腫患者は定期的に手術を行っており、検体採取は順調であるが、正常組織のため提供者が増えなかったことが遅れている一因であると考えられる。また、リアルタイムPCR解析において、ヒトからのRNA抽出やハウスキーピング遺伝子の選定などで安定的に結果を得るまで時間を要した。
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| 今後の研究の推進方策 |
ハウスキーピング遺伝子をアクチン遺伝子に変更し、最適な検量線を設定し、正常皮膚とリンパ浮腫皮膚とを定量的に比較検討する必要があり、現在、計画中である。正常皮膚採取のための手術に関しては年間数十例ありそのうち提供者を見込めるとかんがえられる。組織学的な評価法とリアルタイムPCRによる遺伝子解析のプロトコールはすでに平成29年度に確立しているので、組織的解析・遺伝子発現解析のデータの蓄積をすすめる。また、タンパク発現もあわせて解析を行う方針である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
理由：試験的に5例の検体数でパイロット的にリアルタイムPCRを行ったが、当初は皮膚からのRNA抽出やリアルタイムPCRの解析の不安定さにより、研究の進行が遅れたため、予想したPCR キットやTaqman probeの消費量が少なかったことが主因と思われます。
使用計画：今年度は解析方法が確立したので検体数を増やして解析データを蓄積する予定であり、大量の消耗品等の購入が必要になる見込みです。
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