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2017 年度 実施状況報告書

甘味・うま味受容体遺伝子の転写制御機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号 16K11455
研究機関九州歯科大学

研究代表者

豊野 孝  九州歯科大学, 歯学部, 准教授 (10311929)

研究分担者 中富 満城  九州歯科大学, 歯学部, 講師 (10571771)
片岡 真司  九州歯科大学, 歯学部, 助教 (80364149)
瀬田 祐司  九州歯科大学, 歯学部, 教授 (90291616)
研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード味覚受容体 / 転写調節 / うま味 / アミノ酸 / T1R1 / T1R3
研究実績の概要

うま味はT1R1およびT1R3により受容される。うま味受容体T1R1は、味蕾においてうま味の受容に関与しているが、うま味以外にもアミノ酸を受容すること、および味蕾以外の器官においても発現していることが明らかになっている。そこで本研究では、T1R1遺伝子を発現している筋芽細胞株C2C12を用いて、うま味受容体T1R1遺伝子の転写制御機構の解析を行った。これまでの解析の結果、マウスT1R1遺伝子の上流領域にあるGT-boxが転写の活性化に関与していることが明らかになった。そこで、GT-boxを含むDNA配列への結合タンパク質の同定を、タマビジンを使用したDNA アフィニティ沈降法(DAPA法)により試みた。
C2C12から抽出した核タンパク質を、ビオチン標識したGT-boxを含むDNA配列と反応させた。このDNA配列とタンパク質の複合体を、タマビジン標識磁性ビーズに結合させ、磁力によりDNA-タンパク質複合体を回収した。次に複合体に含まれるタンパク質の解析を、電気泳動法により行った。その結果、60kDaのタンパク質を同定した。次にそのバンドをゲルから切り出した後、トリプシンで処理を行った。切断されたペプチドフラグメントの質量をMALDITOF-MS (matrix-assisted laser desorptionionization-time of flight mass spectrometer)法で測定し、これを 配列データベースMascot で検索することによりタンパク質を同定した。検索の結果、60kDaのタンパク質は転写因子Tbx3であることが明らかになった。
Tbx3はヒトをはじめとする多くの真核生物の発生に必須の転写因子であるが、うま味(アミノ酸)受容体T1R1との関係は明らかになっていない。そこで今後は、T1R1遺伝子の転写調節におけるTbx3の機能解析を行っていく予定である。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究ではマウスT1R1遺伝子の転写調節機構の解明を目的として行った。その第一段階として、マウスT1R1遺伝子の転写活性化配列の同定、およびその配列に結合する転写因子の同定を行った。
レポーターアッセイ法により、開始コドン流-148bp ~ -91bpに転写活性化配列が存在することが明らかになった。次に過剰発現実験および、RNAi法により転写活性化配列中に存在するGT-boxにKLF2が結合し、転写の活性化に関与していることが推察された。さらに、GT-boxを含むDNA配列への結合タンパク質の同定を、タマビジンを使用したDNA アフィニティ沈降法(DAPA法)により試みた。その結果、転写因子Tbx3がGT-boxを含むDNA配列に結合することが明らかになった。

今後の研究の推進方策

DNA アフィニティ沈降法(DAPA法)により、GT-boxを含むDNA配列に転写因子Tbx3が結合することが明らかになった。そこで今後は、T1R1遺伝子の転写調節におけるTbx3の機能解析を以下の内容で調べていく予定である。(1) RNAi法によりTbx3遺伝子の発現阻害を行った場合のT1R1遺伝子の転写への影響。(2)Tbx3遺伝子を過剰発現させた場合のT1R1遺伝子の転写への影響。(3)クロマチン免疫沈降法による、転写因子Tbx3のT1R1遺伝子の上流領域への結合の確認。

次年度使用額が生じた理由

マウスT1R1遺伝子の 転写調節機構の解析において、DNA アフィニティ沈降法(DAPA法)によるGT-boxを含むDNA配列に結合するタンパク質の同定に、予定より大幅に時間がかかった。そのために、その次に実施する予定であった解析の為の試薬の購入を延期したために、未使用額が生じた。

  • 研究成果

    (9件)

すべて 2018 2017

すべて 雑誌論文 (4件) (うち国際共著 2件、 査読あり 4件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (5件)

  • [雑誌論文] Hey1 and Hey2 are differently expressed during mouse tooth development.2018

    • 著者名/発表者名
      Kibe K, Nakatomi M, Kataoka S, Toyono T, Seta Y.
    • 雑誌名

      Gene Expression Patterns

      巻: 27 ページ: 99-105

    • DOI

      10.1016/j.gep.2017.11.004

    • 査読あり
  • [雑誌論文] On the Emerging Role of the Taste Receptor Type 1 (T1R) Family of Nutrient-Sensors in the Musculoskeletal System.2017

    • 著者名/発表者名
      Kokabu S, Lowery JW, Toyono T, Sato T, Yoda T.
    • 雑誌名

      Molecules

      巻: 59 ページ: E469

    • DOI

      10.3390/molecules22030469

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Cutaneous pigmentation modulates skin sensitivity via tyrosinase-dependent dopaminergic signalling2017

    • 著者名/発表者名
      Ono Kentaro、Viet Chi T.、Ye Yi、Dang Dongmin、Hitomi Suzuro、Toyono Takashi、Inenaga Kiyotoshi、Dolan John C.、Schmidt Brian L.Ono K, Viet CT, Ye Y, Dang D, Hitomi S, Toyono T, Inenaga K, Dolan JC, Schmidt BL
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 7 ページ: 9181

    • DOI

      10.1038/s41598-017-09682-4

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Expression of N-cadherin and cell surface molecules in the taste buds of mouse circumvallate papillae.2017

    • 著者名/発表者名
      Matsuyama K, Seta Y, Kataoka S, Nakatomi M, Toyono T, Kawamoto T
    • 雑誌名

      Journal of Oral Biosciences

      巻: 59 ページ: 218-223

    • DOI

      10.1016/j.job.2017.09.002

    • 査読あり
  • [学会発表] ゲノム編集法を用いたマウスアミノ酸受容体T1R1遺伝子の転写調節における転写因子Tbx3の機能解析.2018

    • 著者名/発表者名
      豊野孝,平田祐基,片岡真司,中富満城,瀬田祐司
    • 学会等名
      第123回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • [学会発表] Promoter analysis for mouse T1R1 amino acids (umami) receptor gene in C2C12 cells.2017

    • 著者名/発表者名
      Takashi Toyono, Yuki Hirata, Shinji Kataoka, Mitsushiro Nakatomi, Yuji Seta
    • 学会等名
      16th international Symposium on Molecular and Neural Mechanisms of Taste and Olfactory Perception.
  • [学会発表] C2C12におけるアミノ酸受容体T1R1遺伝子の転写調節機構の解析.2017

    • 著者名/発表者名
      平田 祐基,豊野 孝,細川 隆司,瀬田 祐司
    • 学会等名
      第77回九州歯科学会総会
  • [学会発表] DNAアフィニティ沈降法を用いたマウスうま味(アミノ酸)受容体T1R1遺伝子の転写調節機構の解析.2017

    • 著者名/発表者名
      豊野孝,平田祐基,片岡真司,中富満城,瀬田祐司
    • 学会等名
      第59回歯科基礎医学会学術大会
  • [学会発表] 筋芽細胞株C2C12における,アミノ酸(うま味)受容体T1R1遺伝子の転写調節機構の解析2017

    • 著者名/発表者名
      平田祐基,豊野孝,細川隆司,瀬田祐司
    • 学会等名
      平成28年度公益社団法人日本補綴歯科学会九州支部,中国・四国支部合同学術大会

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公開日: 2018-12-17  

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