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2016 年度 実施状況報告書

細胞外核酸, ナノファイバー, シャペロンによる病原性バイオフィルム形成の検討

研究課題

研究課題/領域番号 16K11537
研究機関国立感染症研究所

研究代表者

泉福 英信  国立感染症研究所, 細菌第一部, 室長 (20250186)

研究分担者 中尾 龍馬  国立感染症研究所, 細菌第一部, 主任研究官 (10370959)
成澤 直規  日本大学, 生物資源科学部, 講師 (90632034)
研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
キーワードバイオフィルム / eDNA / 蛋白質 / Streptocpccus mutans / Staphylococcus aureus / ナノファイバー / シャペロン / クオラムセンシング
研究実績の概要

高齢化と共に、歯周病, 日和見菌感染症, 口腔粘膜疾患, 感染性心内膜炎, 誤嚥性肺炎などの疾患になりやすい人が増えている. しかしこれらの疾患に関わる病原性口腔バイオフィルム(BF)形成メカニズムは詳細に明らかになっていない。口腔常在菌よりも病原性が高まったStaphylococcus aureusなどの日和見菌とStreptococcus mutansなどの口腔常在菌との複合菌BF形成メカニズムを明らかにすることを目的にする。近年BF形成に関わる事が明らかになったeDNA, eRNA, ナノファイバー, シャペロンの混合BF形成への役割を明らかにすることも併せて目的にする. S. mutans UA159とすでに作製されたS. mutans UA159Com依存遺伝子変異株(comC, comD, comE, comX, comR, comS, comYA)の変異株やLuxS依存遺伝子群(luxS, luxR)の変異株を用いてS. aureusとの混合菌BF形成実験をヒト唾液コート96穴マイクロタイタープレートを用いて行った。その結果、混合菌BF形成量は、Com変異株群やLuxS変異群で親株UA159よりも減少することが明らかとなった。これらの結果は、ComやLuxSのようなクオラムセンシングに関わるシステムが混合菌BF形成に関与している事を示している。S. mutansから粗抽出DNAと精製DNAを抽出し、それらを非水溶性グルカン合成能を欠落したS. mutans UA159.gtfBC-変異株に加えバイオフィルム形成量を検討すると、粗抽出DNAが精製DNAよりもBF形成を誘導することが明らかとなった。この粗抽出DNAには、蛋白質が多く含まれていた。この蛋白質とDNAの存在がグルカンに依存しないBF形成に重要であることも明らかとなった。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

口腔常在菌であるS. mutansと日和見菌であるS. aureusとの混合菌バイオフィルム形成が成功したこと、またこの混合菌バイオフィルム形成にはcom依存およびluxS依存クオラムセンシングが関与していることが明らかになったこと。さらに粗抽出DNAがS. mutansのバイオフィルム形成能を欠落したS. mutans UA159.gtfBC-変異株のバイオフィルム形成を誘導したこと。その誘導に蛋白質が関与していることが明らかになったことなどから当初の計画よりも一歩進んだ成果を得ることができた。当初の計画以上に進展していると評価するところだが、本年度計画していたYidC1およびYidC2の変異株の作製の作製とナノファイバー観察が遅れていることもあり、おおむね順調に進展しているという評価をした。

今後の研究の推進方策

まずYidC1およびYidC2の変異株の作製の作製を行い他の変異株と共にナノファイバー観察を行う。
作製されたS. mutans変異株を利用して, 単独あるいは複合微生物(S. aureusおよび C. albicansを含む)のバイオフィルム形成実験をフローセルシステムおよびNOD/SCID.e2f1-/-マウスを用いて行う.
1)フローセルを用いたバイオフィルム形成実験
ヒト唾液をセルにコートしPBSにて洗浄後, 作製した変異株や親株などを単独接種ならびにS. aureusやC. albicansとの混合菌接種をセル表面へ行う.バイオフィルム形成の評価は, LIVE/DEAD® BacLightTM Viability Kitで染色し共焦点レーザー顕微鏡を用いたCOMSTAT解析により蛍光強度を定量的に検討する。 DNaseやRNaseを処理し, バイオフィルム量の変化を上述の方法にて測定する.シャペロンの観察は, 電子顕微鏡および標識YidC1抗体やYidC2抗体などで免疫染色し検討を行う.
2) マウスモデルを用いたバイオフィルム形成実験
0.2%クロルヘキシジンや抗生物質でマウス口腔を一時的に無菌化しPBSにて洗浄後, 滅菌した唾液を処理しPBSにて洗浄, S. mutans変異株とS. aureusやC. albicansを混合し口腔に接種する。eDNA, ナノファイバー, シャペロン産生が上昇あるいは下降した変異株とS. aureusやC. albicansを混ぜた時に, 親株と比較してバイオフィルム内のS. aureusやC. albicansの菌量の増減やバイオフィルム形成量を観察する.

次年度使用額が生じた理由

3月末に行った国際学会および国内学会、英文校閲等の支払いが、事務手続きの関係上支払いが間に合わなくなり、次年度支払いになったため。一部の消耗品が海外生産で届くのが遅くなってしまい、消耗品の支払いが次年度に回ってしまったため。

次年度使用額の使用計画

次年度使用額に関して4月~5月の半ばまでに使用を終了する予定である。平成29年度分は、4月から来年3月にかけて、細胞培養の消耗品、動物実験の消耗品、菌の培養の消耗品等に使用し、論文発表の掲載料、英文校閲料、国内外発表の旅費、学会参加費等に使用し、3月末までに使い切る予定である。

  • 研究成果

    (6件)

すべて 2017 2016

すべて 雑誌論文 (1件) (うち国際共著 1件、 査読あり 1件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (5件) (うち国際学会 2件)

  • [雑誌論文] Raffinose induces biofilm formation by Streptococcus mutans in low concentrations of sucrose by increasing production of extracellular DNA and fructan.2017

    • 著者名/発表者名
      Ryo Nagasawa, Tsutomu Sato, Hidenobu Senpuku
    • 雑誌名

      Applied Environmental Microbiology

      巻: ? ページ: ?

    • DOI

      10.1128/AEM.00869-17

    • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
  • [学会発表] Raffinose induces extracellular DNA-dependent biofilm formation of Streptococcus mutans.2017

    • 著者名/発表者名
      89.Nagasawa R, Sato T, Senpuku H.
    • 学会等名
      95th General Session & Exhibition of the International Association for Dental Research
    • 発表場所
      San Francisco, Moscone convention center
    • 年月日
      2017-03-25 – 2017-03-25
    • 国際学会
  • [学会発表] Streptococcus mutansのグルカン依存およびグルカン非依存バイオフィルム形成へのポリピロールの効果2017

    • 著者名/発表者名
      泉福英信、永沢亮、鈴木雄祐、大西真
    • 学会等名
      第90回日本細菌学会総
    • 発表場所
      仙台、仙台国際センター
    • 年月日
      2017-03-19 – 2017-03-21
  • [学会発表] Effects of SCFAs on attachment and biofilm of Actinomyces oris.2017

    • 著者名/発表者名
      Suzuki I, Shimizu T, Senpuku H
    • 学会等名
      95th General Session & Exhibition of the International Association for Dental Research
    • 国際学会
  • [学会発表] Streptococcus mutansにおけるFructanaseのCSP依存的Quorum sensingへの影響2016

    • 著者名/発表者名
      鈴木雄祐、荒井俊明、小倉直美、近藤壽郎、泉福英信
    • 学会等名
      第58回歯科基礎医学会
    • 発表場所
      札幌、コンペンションセンター
    • 年月日
      2016-08-25 – 2016-08-25
  • [学会発表] Streptococcus mutansのeDNA依存的バイオフィルム形成に対す るラフィノースの影響2016

    • 著者名/発表者名
      永沢亮、泉福英信
    • 学会等名
      第30回日本バイオフィルム学会
    • 発表場所
      東京、第一三共本社ビル10F会議室
    • 年月日
      2016-07-02 – 2016-07-02

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公開日: 2018-01-16  

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