| 研究課題/領域番号 |
16K11635
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| 研究機関 | 東京歯科大学 |
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研究代表者 |
三浦 直 東京歯科大学, 歯学部, 准教授 (10266570)
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| 研究分担者 |
志澤 泰彦 日本大学, 生物資源科学部, 講師 (30413131)
三宅 菜穂子 東京歯科大学, 歯学部, 講師 (40276978) [辞退]
塚越 絵里 東京歯科大学, 歯学部, 助教 (60615384)
田辺 耕士 東京歯科大学, 歯学部, 助教 (80638156) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | オッセオインテグレーション / インプラント / チタン / 表面改質 / サイトカイン / 微量タンパクの検出 / 創傷治癒 |
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| 研究実績の概要 |
28年度から、インプラント埋入術によってなされた創傷に対する治癒反応に関わる、血液を中心としたサイトカイン、ケモカインについて遺伝子レベルおよびタンパクレベルにおいて検出を中心に行ってきた。しかしいずれも非常に微量で（量的にはpico lebel）当初中心的存在として考えていたCXCL12(SDF-1)は検出できなかった。そこで、創傷治癒の反応を様々な観点から実験するために、29年度は相当量の試料を、遺伝子組み換えを駆使して取得することを念頭において取り組むことを目標とした。このタンパクは、市販品はmgオーダーで数百万円と高価な試薬なので、大腸菌に当該遺伝子のヒト型DNAを組み換え実験により合成させ、細胞外に分泌させることをゴールとし、実験を行った。CXCL12 geneはvarientが3種知られており（Genomics, 28, 495-500, 1995）、そのうち生理活性が同じSDF1αとSDF1βを選択した。両者はN末およびC末の構造の違いがあり、アミノ酸の電荷の違いだけである。この配列を元に2本鎖linear DNAの合成を行った。pPAL7 vectorに挿入し、E. coli BL21にて発現させた。IPTG発現誘導を行ったところ、誘導開始3時間後で飽和に達していた。しかし、発現したタンパクは膜画分に存在し、可溶化するステップが必要なことが判明した。目的タンパクの効率の良い発現の条件を見つけるため、温度、培養時間、膜からの溶出条件等を検討した。大腸菌ではタンパクの発現まではうまく行くものの、タンパクの精製段階でカラムから酵素による切断がうまく行かないようで、効率の良いタンパクの回収までは至らなかった。大腸菌体内で封入体になってしまっていた。さらに条件を検討して、組み換えタンパクの大量生産を確立すべく研究を続行している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度からの実験開始以降、ターゲットとしてきたCXCL12が、非常に検出感度の低いケモカインであることが判明したので、本年度から実験の方向性を少し変え、まずターゲットのタンパクを遺伝子組み換えにより大量生産することを当面の目標とした。既知の遺伝子配列を元に、DNAを合成し大腸菌に組み換え体を生産させることとした。発現までは順調に進むことができたが、支障なく効率よく大量に生産させるために、様々な条件検討を継続し、今年度はある程度目途がついた。来年度はこの大量生産システムを完成し、当該タンパクの性状、活性など、創傷治癒に関わるデータを取得する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
組み換え体をintactな状態で、できるだけヒトの生体内で存在する構造で大量生産し、精製品を取得したいため、当該遺伝子を発現させる宿主を大腸菌からBrevibacillusの発現システムを利用する計画である。これはグラム陽性菌で高効率分泌発現を特長としている。このシステムを確立すれば、購入すると非常に高価なタンパクを大量生産できるので、限られた研究費の中で、当該タンパクのチタンへの付着特性など量を必要とする実験に際限なく活用できるので、創傷治癒の原理などの解明につながると考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
29年度使用額は、ほぼ科研費採択決定時の2年目予算の金額相当を使用している。
28年度で翌年度に繰り越した金額がそのまま残金として、収支簿上残っている状況である。当初の計画路線から2年目の研究計画について、若干の変更を余儀なくされたが、引き続き変更した実験系のための予算執行にフレキシブルに対応可能とするため、物品費として最終年度に繰り越すことを決定した次第である。
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