| 研究課題/領域番号 |
16K11676
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
杉山 円 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (90451814)
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| 研究分担者 |
藤原 夕子 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (50466744)
疋田 温彦 東京大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (60443397)
西條 英人 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (80372390)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 幹細胞シグナル / RNA-Seq / トランスクリプトーム解析 |
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| 研究実績の概要 |
前年度、共培養後のMSCをFACS分離し、非共培養MSCとの遺伝学的相違点をマイクロアレーにて解析し比較検討をおこなったところ、MSCのステムネスに寄与すると思われる網羅的遺伝子発現変動解析より着眼4遺伝子を検討対象とした。これら遺伝子のインヒビターを用い機能欠損モデルを作製し、MSC特性変化を評価したところ、着眼各遺伝子機能抑制によって、MSC特性の低下および向上を認めたことから、本年度は最終的な因子同定およびこれらを用いた再生骨作製をおこなった。インヒビターは臨床導入を目指すうえで、GMP基準に抵触する可能性があるため、着眼遺伝子がシグナル制御によって機能を抑制または促進することを鑑みて、インヒビター添加後のMSCと正常MSCとのシグナル変化を次世代シーケンサーを用いて解析をおこなった。その結果、着眼4遺伝子のインヒビター添加群において、全てに共通して発現上昇および抑制を認めるシグナルがいくつか存在することが示唆されたことから、これらのシグナルをin silicoにてgene ontology (GO)解析、パスウェイ解析をおこない、幹細胞特性に関与するシグナル内に存在し、それらのシグナルが伝達される経路から、マイクロアレーで選定した4遺伝子を通過する因子、つまりマスターレギュレーターを探索した。その結果、4遺伝子を発現制御する可能性のある数十個のシグナル因子を特定した。さらに、このうちGMP基準を満たした因子の探索をおこなったところ、最終的に10シグナル因子に関して、選定をおこなった。これらの因子培地への添加方法・条件ををシグナル因子の半減期から推測し、検討をおこなっている。また、同時にBMP2/アテロコラーゲンにより作製した再生骨の作製をおこない、さらに頭蓋骨部分欠損モデルを作製した。次年度はこれをもとに骨再生の可能性を検討する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
マイクロアレー後の網羅的全検出遺伝子からの絞り込んだステムネス関連4因子について、解析作業を進めていたところ、最終的に臨床応用する際に、GMPに準拠している必要性から、当該因子はすべて準拠していないことが判明した。したがって、本課題を停滞させずに遂行するために、次世代シーケンサーを用いてステムネス関連4因子のトランスクリプトーム解析から、GMPに準拠する幾つかのシグナル因子を選定した。当年度では再生骨仕様の決定までを計画していたが、選定因子の易調達性およびモデル動物、再生骨の作製は完了していることから、目標に対してほぼ同等の進捗と捉えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度に特定したシグナル10因子の機能解析は現在までのところ進んでいないため、当該因子の造血-間葉相互作用における作用機序への影響、効果を立証することは重要であると考える。したがって、研究を進捗するためには現在実施予定としているin vitro評価と同時にin vivo評価も実施していくことが重要であると考える。まずは機能的 再生骨作製技術のベースとなる足場人工骨の作製技術を確立させ、その後にシグナル因子を添加した足場材の作製と因子の徐放効果の検証をおこなっていき、in vitroでの結果と照らし合わせていき、最終的な再生骨の仕様を決定し、技術確立をおこなっていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当年度、幹細胞シグナル因子の特定に用いた次世代シーケンサーのsingle cell RNA-Seq解析は、網羅的遺伝子解析を主とするマイクロアレーでは再現性を含め、遺伝子の特定に要していた費用が、in silicoでの解析を主とすため遺伝子選定に要する費用を抑制できたこと。また、特定因子を最終的に臨床応用を目指すにあたり、GMPに準拠した試薬でなければならないことから、試薬等の選定に相当時間を要したことから、本来検討に充てる予定であった費用が未使用となったことから、繰越が生じてしまったと考える。
さらに次年度は、最終年度であることから、加速的に研究を進捗させるために不可欠なFACSを相当回数使用することが考えられ、機械稼働に多くの資金を投下する必要がある。さらに選定因子を用いた骨再生技術を確立するために、実験モデル動物も多く必要とする。
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