研究課題/領域番号 |
16K11687
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研究機関 | 広島大学 |
研究代表者 |
神田 拓 広島大学, 病院(歯), 助教 (00423369)
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研究分担者 |
岡本 哲治 広島大学, 医歯薬保健学研究院(歯), 教授 (00169153)
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研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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キーワード | Cowden症候群 / iPS細胞 / がん抑制遺伝子Pten |
研究実績の概要 |
Cowden症候群の原因遺伝子であるがん抑制遺伝子Pten(phosphatase and tension homolog deleted on chromosome10)の変異の検索に関し、広島大学倫理規定(倫理申請許可番号:第ヒ-58号および第ヒ-72号)に基づき当診療科にて既往歴から診断基準を満たしたCowden症候群患者より承諾のうえ得られた末梢血からCowden症候群疾患特異的iPS細胞誘導を行った。当該患者より採取した末梢血リンパ球(CS-PBMC)を採取し,PTEN遺伝子ヘテロ変異を次世代シークエンサー(イルミナ社)およびサンガー法にてcodon 341 PhenylalanineのLeucineへ置換、codon 343 Valineのstop codonへの置換同定した.本患者の変異PTEN蛋白はcodon342以降のC-末端側が欠損していると考えられ,同変異については現在まで報告はない(投稿準備中)。さらにCS-PBMCを用いセンダイウイルスベクター(SeVdp:独立法人産業技術研究所より供与)を用い,Cowden症候群特異的iPS細胞の樹立をインテグレーションフリー.フィーダーフリー・無血清培養系にてCS-iPSCを樹立した。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Cowden症候群は全身諸臓器の多発性過誤腫と高率に悪性腫瘍を合併する疾患で,がん抑制遺伝子PTENの変異が関与する常染色体優性遺伝である。本学倫理規定に基づき同意を得られたCowden症候群患者末梢血よりDNAを抽出しPCR-SSCP法を用いて,各エクソンにおけるPTEN遺伝子変異の有無の可能性を検討したが,明らかなバンドの数やシフトなどの異常は認められなかった。次に次世代シーケンサーによる遺伝子変異を網羅的に解析したところ,Cowden症候群の原因遺伝子であるPTEN遺伝子に3カ所の変異を検索しえた。変異遺伝子はいずれもPTEN遺伝子のエクソン8領域で同一のリード上にあることから、すべて同一アレル内に存在することが明らかとなった。本変異はこれまで報告はなく新規変異であると考えられ、さらに乳がんに関連するBRCA2やHEXBの変異や消化管病変に関連するMLH1やMSH6などの遺伝子変異が多数検出され、本患者の既往に関連していると推測された。本変異によりPTENのフレームシフトが生じ、ストップコドンが入ることで、PTEN蛋白のC末端部がトランケートされている可能性が示唆された。次にゲノムへのintegrationのないセンダイウイルス(SeVdp)を用いたがん抑制遺伝子PTEN変異Cowden患者由来iPS細胞を樹立し,Cowden症候群由来iPSC(CS-iPSC)の樹立を行った。誘導の評価は未分化マーカーの一つであるALP染色にて確認した。誘導したCS-iPSCの未分化マーカーの蛋白発現及び遺伝子発現を、蛍光免疫染色法・RT-PCR法を用いて各種未分化マーカーを発現を確認した。成果については日本口腔科学会,The 14th International conference on endocrinologyにて発表した。研究進行は概ね申請計画に沿って進展している。
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今後の研究の推進方策 |
Cowden症候群特異的iPS細胞を用いて、Pten遺伝子および各種未分化マーカーの発現量をドロップレットデジタルPCR(ddPCR)で検索を行い、またPTEN,リン酸化PTEN(pPTEN)およびリン酸化AKT(pAKT)の発現をWestern blot法で解析を行う。各種未分化マーカーの発現とiPS細胞の未分化能を検索し、in vitroおよびin vivoでのテラトーマ形成による3杯葉への多文化能性を有しているかについて検索を行う。同時に健常人との差異に関し、健常人由来iPSCと比較検討を行うことで本症候群の発症メカニズムの解明ならびに新規治療法の開発について検討を行っていく。
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次年度使用額が生じた理由 |
研究計画に基づき無血清培養系における疾患特異性iPS細胞樹立の維持において経費が必要であった。また本細胞を使用し未分化性についてALP活性および未分化マーカー(Oct3/4.Nanog,Sox2,SSEA-4,Tra-1-60など)の遺伝子発現およびタンパク発現を検討する必要があった。
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次年度使用額の使用計画 |
樹立したiPS細胞無血清培養系において,脂質フォスファターゼである変異PTENのチロシンホスファターゼの活性,AKT-mTORシグナル伝達系の上流・下流因子であるPI3K-PIP3シグナル,Akt,BtK,PDK1などPIP3エフェクター分子の細胞増殖亢進,アポトーシス制御能,セントロメアの不安定性,DNA修復異常等について正常型との比較検討をクロマトグラフィーによるメタボリズム解析を行う.
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