| 研究実績の概要 |
サル腱細胞に対するメカニカルストレス負荷の実験について次世代シーケンサーを用いて遺伝子網羅的発現解析をすすめた。ニホンザル（オス、５歳１０か月齢）をサンプル対象として、京都大学霊長類研究所にて解剖を行い、咬筋腱膜（MA）と側頭筋腱（TT）、ならびにアキレス腱（AT）を採取した。採取した腱組織は酵素法にて処理した。具体的には、0.2% collagenase I solutionを用いて、３７℃で１８時間コラゲナーゼ処理し100μmフィルターを行った。この細胞を細胞培養dishに播種して７日間培養し、増殖したものをBioFlex 6 well plateへ播種して、Flexcell社のFX-3000を用いて伸展刺激を加えた。伸展刺激の条件として、培養プレート面積はサインカーブに基づき、０．５秒間で０％から１０％まで連続的に上昇し、次の０．５秒間で連続的に０％に戻るように変化をさせるプロトコールを採用した。伸展刺激の持続時間は４８時間とした。刺激前の０時間と刺激後４８時間のサンプルについて、培養細胞にQIAZOLで処理しセルスクレイパーにて回収した。RIN値を測定し、total RNAの品質が良好であることを確認した。遺伝子網羅的発現解析のためにRNAの濃度を測定し、次世代シーケンサーでの解析を行った。解析はMA, TT, ATそれぞれにおける０時間と４８時間の比較を行った。遺伝子発現変動が認められる遺伝子（DEG: differential expression genes）を求めたところ、多数の遺伝子が同定されたため、選択の基準をきつく設定してFDR (false discovery rate) < 10E-10を満たす遺伝子数を調べた。統計的に有意差のあるDEGの数は、MAでは1914遺伝子、TTでは2195遺伝子、ATでは3697遺伝子であった。
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