• 研究課題をさがす
  • 研究者をさがす
  • KAKENの使い方
  1. 課題ページに戻る

2016 年度 実施状況報告書

口腔癌におけるSlit/Roboシグナル作用機構の解析とバイオマーカーの開発

研究課題

研究課題/領域番号 16K11716
研究機関東京大学

研究代表者

安部 貴大  東京大学, 医学部附属病院, 特任講師 (20383250)

研究分担者 阿部 雅修  東京大学, 保健・健康推進本部, 講師 (10392333)
森川 鉄平  東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 准教授 (80451772)
浜窪 隆雄  東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (90198797)
研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード口腔癌 / Robo1 / Slit
研究実績の概要

本研究は、近年神経発生における軸索誘導分子として知られる Slit/Robo が、癌に深く関わ っていることに着目し、未だ情報の少ない口腔扁平上皮癌に対して、どのように作用するかを検証することを目標としている。このため、口腔扁平上皮癌における Slit/Robo シグナルの系統的解析ならびに臨床検体を用いた多段階における発現様式について解析を行い、また、体液中の細胞外小胞 Exosomeを回収し、遊離型 Roboを検出できるかを課題として各項目を掲げて検討を進めている。Slit/Roboシグナルが悪性化予測因子として機能すれば、早期口腔癌の検出力・感度向上につながり、体液を用いた口腔がん検診への応用にも発展が期待できると考える。まずは口腔扁平上皮癌に関する Robo1 の発現について、口腔癌細胞株を用いて検討を進めており、同時に学内倫理委員会の審査承認を得て(審査番号 10557-(1))臨床研究も遂行中である。特に、Robo1 について免疫組織学的検討を行い、悪性度によって発現様式が異なることを示唆した知見も得られている。膜貫通型タンパク質 Robo が ADAM10 や MMP、γ-secretase などの切断酵素による shedding の修飾を受けて細胞内外へ遊離することが分かっていることから、遊離型 Robo タンパク質の動態についても我々は着目しており、今後その機能についても明らかにしていきたい。また一方、実際の臨床検体(組織、血液)を対象とした免疫組織学的・生化学的検討やプロテオミクス解析、ならびに定量的 RT-PCR 法を用いたSlit/Robo の発現検討を行い進行中である。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

Robo 受容体は、ヒトにおいては現在までに4 種類のタイプがあることが知られて いるが、そのシグナル伝達についてはいくつかの経路が明らかにされてきている[Gara RK, et al. Drug Discov Today 2015, 20(1):156-164.]。特に各サブタイプの発現パターンと E、 N、 P-cadherin との相互作用の違いによって、シグナル伝達経路が異なることが分かっている。このことから、口腔癌細胞やその他の臓器由来の細胞を用いてRobo1を中心に発現パターンの解析が遂行できた。今後cadherin との関連につ いても手がかりを得たい。発現検討には定量的RT-PCR のほか、タンパク質レベルでの発現様式についてウエスタンブロット法、免疫染色、フローサイトメトリーなどの検討を行い、知見を得た。Slit のうち最も研究が進んでいる Slit2についての検討を行った。Robo1-Slit2シグナルが増殖、接着、細胞死など、いづれの細胞機能に関与しているがを確認するため、化学遊走の抑制因子としての機能を持っていることが知られている知見を検証することを行った。Slit2についても口腔癌細胞に対して作用することが示唆され、引き続き種々の癌細胞との比較をしながら chemotaxis が濃度依存性にどのように変化するか確認していく予定である。当初の計画に従い、データを得ており、おおむね順調に進展していると思われる。

今後の研究の推進方策

in vitroの系について、Slit 誘導による細胞増殖能の検討を行っていく。MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromide)アッセイを 用いて細胞増殖能を測定する。Slit の濃度勾配による細胞増殖能の検討を行い、細胞株の違いによる反応性についても解析したい。p43/44 MAPK経路、PIK3/Akt経路、Ras/ERK経路、Wnt/β-catenin経路、TACE/MMP、secretase、caspase 阻害などのシグナル作用を確認したい。
本研究についての説明に対して同意書に署名が得られ、切除手術(生検術を含む)と血液採取を実施できた成人の患者における検討症例目標数は合計 30 例程度であるが、検体は採取した切除標本の一部(癌部、非癌部)、および採取前後の血液を利用する。 i) 組織検体について、免疫組織学的検討:一次抗体はマウス由来抗 Robo1 モノクローナル抗体(クローン A7241A; 先端研)、Slit/Robo シグナル関連因子の抗体を用い、二次抗体はシンプルステイン MAX-PO(ニ チレイ)による DAB 染色などを用いて確認を予定している。なお、抗体濃度原濃度 10mg/ml で、500 倍 希釈(溶質量 20μg)の試適条件を確立している。生化学的検討:A7241A を用いたウェスタンブロット法により Robo1 を同定する。リアルタイム PCR 法により mRNA レベルの発現量を同定する。免疫沈降と質量分析法を組合せた複合体プロテオミクス解析:B5209B 結合磁気ビーズ(先端 研)などを遂行できたらと考えている。

次年度使用額が生じた理由

本年度開始年度ということもあり、実験系の確立に時間を要することとなった。分担者の浜窪氏の要する抗体準備、病理学の森川氏との打ち合わせを重ねる必要があった。実験の着手までにはある程度の予備実験を行っていたが、実験試薬などの必要経費はある程度軽減でき、現有のもので事足りたことが次年度使用額が生じた主な理由となる。また、臨床検体を採取することに時間のエフォートが割かれており、必然的に経費使用に至らなかったこともあげられる。
また抗体系の試薬は保存がききにくいため、できるだけ使用の直前に購入することが望まれるため、予定までは購入を控えたことも、高額な支出がなかった理由としてあげられる。

次年度使用額の使用計画

各種抗体の購入、またSlit-Roboシグナル伝達の解析に用いる予定の選択的阻害剤、p43/44 MAPK 経路:選択的 MEK 阻害剤 U0126、PIK3/Akt 経路:選択的 PI3K 阻害剤 wortmannin、Ras/ERK 経路:選択的 AP-1 阻害剤 curcumin、Wnt/β-catenin 経路:Dvl(disheveled)の直接的阻害剤 NSC668036、E-cadherin 結合阻害剤 Imatinib、TACE/MMP、secretase、caspase 阻害:TAPI-1、L-685458、Ac-LEHD-CMK などを具体的に購入予定と考えている。また、測定に用いるRT-PCRの試薬酵素なども継続して必要で、これらの購入にも支出が予想される。

  • 研究成果

    (3件)

すべて 2017 2016

すべて 学会発表 (3件)

  • [学会発表] 口腔癌細胞株を用いた軸索ガイダンス因子Roundabout homolog (ROBO) 1の発現解析2017

    • 著者名/発表者名
      小松紀子, 安部貴大,三井健一,阿部雅修,西條英人,星和人,高戸毅,浜窪隆雄
    • 学会等名
      第35回日本口腔腫瘍学会総会
    • 発表場所
      福岡国際会議場、福岡
    • 年月日
      2017-01-26 – 2017-01-27
  • [学会発表] 口腔癌細胞株を用いた軸索ガイダンス因子Roundabout homolog (ROBO) 1の発現解析2016

    • 著者名/発表者名
      小松紀子, 安部貴大,三井健一,阿部雅修,西條英人,星和人,高戸毅,浜窪隆雄
    • 学会等名
      第40回日本頭頸部癌学会
    • 発表場所
      ソニックシティ さいたま
    • 年月日
      2016-06-09
  • [学会発表] 口腔扁平上皮癌におけるSlit/Roboシグナル作用機構の解析2016

    • 著者名/発表者名
      安部貴大,小松紀子,三井健一,阿部雅修,西條英人,星和人,浜窪隆雄,高戸毅
    • 学会等名
      第70回日本口腔科学会総会
    • 発表場所
      福岡国際会議場 福岡
    • 年月日
      2016-04-16

URL: 

公開日: 2018-01-16  

サービス概要 検索マニュアル よくある質問 お知らせ 利用規程 科研費による研究の帰属

Powered by NII kakenhi