| 研究課題/領域番号 |
16K11722
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
村上 純 岡山大学, 大学病院, 助教 (40362983)
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| 研究分担者 |
岡田 俊輔 岡山大学, 大学病院, 医員 (00759681)
竹中 文章 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (10642522)
江口 傑徳 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (20457229)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 口腔癌 |
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| 研究実績の概要 |
初年度はエクソソーム分画を定量的かつ確実に回収する手法の確立に終始し、安定的なエクソソーム回収が可能となった。正常上皮細胞株RT7およびヒト舌癌由来細胞株HSC3を用いて様々な成長因子添加条件におけるエクソソームの放出条件を検討した。それぞれの細胞を血清飢餓条件（DMEM）、TGFβ添加条件（ｍTeSR1）、EGF添加条件（KGM-2）下にて培養し、培養上清を回収後、エクソソーム抽出試薬（Invitrogen社）を添加後遠心し、pelletにPBSを添加した溶液をExosome画分のタンパク質とした。タンパク定量(Thermo SCIENTIFIC)では、正常細胞株RT7と比較して舌癌細胞株HSC3においてエクソソーム画分のタンパク質の増量を認めた。SDS-PAGE（Bio Rad）による電気泳動では、両細胞株ともにエクソソームマーカーとして知られているCD9の分子量付近にタンパク質の存在が確認でき、ヒト舌癌由来細胞株でもCD9がエクソソームのマーカーとして利用できることを示唆できた。CD9量をExoscreenにて定量したところ、舌癌細胞株HSC3は、EGF添加条件にてCD9量の増量を認めた。現在、簡便な（エクソソーム分泌のマーカーとしての）CD9定量手法として、抗CD9抗体を用いたウェスタンブロッティングを計画し、ウェスタンブロッティング法にて使用可能な抗CD9抗体の選定ならびに条件設定中である。またヒト舌癌由来細胞株HSC3以外のヒト口腔癌由来細胞株でもエクソソーム回収と放出条件の検討を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
エクソソーム分画の回収手法を確立できた点、口腔癌由来細胞株においてもCD9がエクソソームマーカーとなることを確認できた点が、スムーズな進捗状況につながったと考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、Exosomeマーカー抗CD9抗体を用いたウェスタンブロッティングを計画し、ウェスタンブロッティング法にて使用できる抗CD9抗体の選定中である。またヒト舌癌由来細胞株HSC3以外のヒト口腔癌由来細胞株でもエクソソーム回収と放出条件の検討を進めている。さらに、どのような細胞培養条件下にて各癌細胞株がエクソソーム分泌を促進、もしくは抑制するのか、条件設定検討する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
エクソソーム抽出を簡便、安価に出来る手法を確立できたため、条件設定などの試行錯誤含め予定していた金額を安価に抑えることに繋がった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
エクソソーム抽出手法ならびにその確認手法を安価に抑えることが出来たため、当初計画していた細胞株数を増やして追加検討することを計画している。
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