研究課題
本研究は、休眠している骨髄播種癌細胞（bone marrow-disseminated tumor cells: BM-DTC）の癌進展に果たす役割と、その分子基盤を明らかにすることを目的とする。まず我々は、休眠BM-DTCという亜集団にクローナリティが存在するかどうかを検証するために、DNAバーコーディング法を採用し、各種基礎検討を行った。まず、DNAバーコードレンチウイルスベクターをヒト頭頸部癌細胞をはじめいくつかの癌細胞株に感染させ、個々の細胞の追跡に適した感染効率を定めた。実際に、感染後に抗生剤で選別し、シングルクローン化した細胞に組み込まれているバーコード配列をサンガーシーケンス法で解読したところ、ほぼすべてのクローンがそれぞれ1種類のバーコード配列をもつという想定通りの結果が得られた。したがって、個々の細胞標識と追跡が十分可能であることが示唆された。さらに、バーコード標識癌細胞のDNAから良好なクオリティの次世代シーケンサー（NGS）解析用ライブラリが調製可能であることも確認することができた。以上の基礎検討結果から、DNAバーコーディング法による休眠BM-DTCのクローナリティの検証は十分可能であると考えられた。並行して、休眠BM-DTCの起源を辿ることができるよう、バーコード標識シングルセルクローンの樹立とバンキングを進めている。一方で、CRISPR/Cas9 遺伝的スクリーニングによって、BM-DTCの休眠や停留に必須の遺伝子を同定することを試みている。現在、Cas9安定発現癌細胞株の樹立過程にある。
2: おおむね順調に進展している
想定以上にDNAバーコーディングに関する基礎検討が進み、NGS解析に十分なクオリティのライブラリも作製することができた。当初、初年度に検討を予定していた「休眠BM-DTCの特性解明」については、まだ十分な知見は得られていないが、クローナリティの検討の際に、同時に詳細な解析が可能であると考えている。また、今後行う予定であるCRISPR/Cas9スクリーニングに向けた準備も並行して進めることができている。
基本的には、当初の研究計画を基盤として以下のように検討を進める。バーコードライブラリ感染癌細胞をマウスに移植し、移植部位や骨髄をはじめ各臓器から癌細胞を採取し、NGSによりバーコード配列の網羅的解析を行う。これにより、休眠BM-DTCや転移巣の均一性・不均一性を検証する。同時に、休眠BM-DTCサブクローンを樹立し、その特性（遺伝子発現プロファイルなど）を解析するこで、機能的な面でのクローナリティの検証も行う。CRISPR/Cas9スクリーニングについては、sgRNAライブラリウイルスベクターを作製し、Cas9安定発現細胞株に感染させる。これにより遺伝子をランダムにノックアウトし、骨病巣が出現した場合には、同転移細胞集団由来DNAをNGSで解析し、骨髄での癌細胞の休眠や滞留に必須の遺伝子の同定を試みる予定である。以上の検討で得られた知見を随時統合することで、休眠BM-DTCの特性解明と転移・再発機構の理解を目指す。
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すべて 雑誌論文 (5件) (うち査読あり 5件、 オープンアクセス 3件、 謝辞記載あり 5件) 学会発表 (5件)
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