| 研究課題/領域番号 |
16K11767
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| 研究機関 | 日本歯科大学 |
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研究代表者 |
吉村 建 日本歯科大学, 新潟生命歯学部, 准教授 (90297953)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 舌乳頭 / 遺伝子導入 / エレクトロポレーション法 |
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| 研究実績の概要 |
妊娠ラットより胎仔を得てその胎児組織より舌組織の分離を行った。分離舌組織は培養液に静置の後、遺伝子導入効率並びに導入部位のさらなる詳細な確認のため蛍光タンパクレポーター遺伝子ベクターを用いたエレクトロポレーション法による遺伝子導入を行った。舌組織は数日培養し、その過程においてLED-UVイルミネータ照射下にて経時的に導入部位の蛍光タンパクレポーター遺伝子の蛍光の確認と画像取得を行った。その後培養された胎仔舌組織の浸漬固定を行い、厚さ約50umの凍結切片を作製し浮遊させた後スライドグラスに進展と封入を行った。試料は本学現有のZeissLSM710共焦点顕微鏡で形態学的観察を行い、併せて蛍光タンパクレポーター遺伝子による導入範囲の評価として蛍光による発現範囲の評価を行った。その結果、エレクトロポレーション法を用いた蛍光タンパクによる遺伝子導入においてこれまでの研究結果によるパラメータの最適化が計られ、かつ実体顕微鏡下観察で広範囲な導入部位が観察された。今回の実験成果とこれまでの研究結果をまとめ、学術誌 Microscopy and imaging scienceに発表（A simple electroporation method of green fluorescent protein-transfection and in vitro imaging of organ-cultured embryonic lingual tissue）を行った。
しかしながら、共焦点顕微鏡観察による組織深部の精査、とりわけ間葉領域における遺伝子導入細胞の量はやや少なく、当初、本研究課題において計画された上皮・間葉に組織を分画し解析するという目的には不向きである事が判明した。これにより本研究課題においてはさらに高い遺伝子導入効率が求められることより、新たな導入手法が求められることとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
平成28年8月より本学動物実験施設の改築工事が開始され、それに伴い施設の利用ができなくなり実験の一時凍結を余儀なくされたため。同時に当初予定されたエレクトロポレーター遺伝子の導入による導入細胞の培養舌組織深部の分布量が当初想定されたものよりも少ない事が判明したために、さらなる効率の良い遺伝子導入方法の検討が急遽必要とされたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成29年度においては、これまでに行われたエレクトロポレーション法でなく、さらなる高効率の遺伝子導入法による方法に切り替えて実験を遂行する。具体的な方法としてはAAV（アデノ付随ウイルス）による遺伝子導入法を検討している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成28年8月より動物実験施設改築工事開始に伴い施設の利用が停止され、実験遂行の一時凍結を余儀なくされることとなった。加えて当初予定されたエレクトロポレーター法による遺伝子導入により培養舌組織内深部の遺伝子導入細胞の分布量が当初想定されたものよりも少ない事が判明したため、さらに高効率の遺伝子導入方法の検討が急遽必要とされたが、検証実験を行うためには動物実験施設の落成と運用開始を待たねばならなかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成29年度には従前より行ってきたエレクトロポレーションではなく、さらに遺伝子導入効率の高い方法であるAAV（アデノ付随ウイルス）を用いた導入手法により実験を遂行する。本研究経費はこの手法に必要とされる実験試薬ならびに機材に充当する。
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