| 研究課題/領域番号 |
16K11786
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
星島 光博 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (30736567)
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| 研究分担者 |
服部 高子 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (00228488)
青山 絵理子 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (10432650)
滝川 正春 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (20112063)
西田 崇 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (30322233)
上岡 寛 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (80253219)
久保田 聡 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (90221936)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 骨組織 / 骨細胞 / 細胞内輸送 / Rab14 / CCN2 |
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| 研究実績の概要 |
申請者はこれまでに軟骨分化促進因子CCN2の結合因子として細胞内輸送制御因子Rab14を同定し、各々が骨および肺組織で極めて高い発現を示すことを明らかにした。本研究ではRab14とCCN2の分子間相互作用が、骨および肺組織の基質産生に及ぼす影響を解明することを目的とした。今年度はRab14とCCN2が、骨細胞においてどのような機能を示しているかを検証し、以下の結果を得た。
1. 骨細胞は骨を構成する細胞の中で最も多く存在する細胞であり、骨組織のリモデリングに深く関与している。そこで、骨細胞の成熟過程におけるRab14とCCN2の影響を調べるために、骨細胞様細胞株であるMLO-Y4細胞をコラーゲンゲル培地中で3次元培養した。MLO-Y4細胞は、培養開始3-7日目で骨組織中の類骨骨細胞と類似した形態的特徴を持つようになり、10日間以降の長期培養で成熟骨細胞と類似した形態的特徴を持つようになった。また、骨細胞マーカーとして成熟骨細胞で高発現するSostと幼若骨細胞で高発現するDmp1の遺伝子発現を定量RT-PCRにより評価したところ、Sostの発現量は3次元培養開始15日目に最も上昇し、Dmp1の発現量 は7日目から15日目にかけて、著しく減少することを確認した。
2. Rab14とCCN2が骨細胞の成熟過程に与える影響を調べるために、3次元培養開始7日目と15日目のMLO-Y4細胞において、両者の遺伝子発現レベルの変化を定量RT-PCR法により評価した。その結果、3次元培養7日目と比較して15日目では、Rab14とCcn2のmRNAの発現は優位に上昇していた。また、同様にⅠ型コラーゲンやカルシウム結合タンパク質であるオステオカルシンのmRNAの発現も上昇していた。
以上の結果より、骨細胞の成熟に伴ってRab14とCCN2の発現が亢進し、基質産生を性化している可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では骨あるいは肺組織の細胞において、Rab14とCCN2の相互作用がその分化や基質産生に及ぼす影響を明らかにすることを目的としている。本年度は骨組織におけるRab14とCCN2の役割として、骨細胞の成熟、基質産生への影響を明らかにしてきた。今後分子レベルの挙動を解析していく上で、骨細胞の3次元培養系を構築できたことは、大きな成果であった。また、この培養系を用いて、骨細胞の成熟過程におけるRab14とCCN2の発現レベルの上昇を明らかにできた。現在、これらの結果をもとに骨細胞においてRab14とCCN2の発現制御を行うことで、両者の挙動や細胞内のストレス変化の解析を行っていており、進行状況は概ね順調であると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
I. Rab14とCCN2の相互作用が骨細胞の成熟過程に及ぼす影響について検討する。
骨細胞が成熟することで、Rab14およびCCN2のmRNAの発現レベルが上昇しており、その生理作用にも何らかの影響が現れると予測される。そこで、骨細胞株の3次元培養系で、Rab14およびCCN2の発現を抑えることで、これらの細胞に生じる変化をコントロールと比較する。特に細胞内で小胞輸送の秩序が崩れ、輸送されなかったタンパク質が細胞内に蓄積する可能性があるため、小胞体やゴルジ体ストレスに関与する因子の発現レベルを解析する。さらに、骨細胞あるいは骨芽細胞は、基質タンパク質を生産・分泌していることから、Rab14とCCN2の結合親和性や発現量をコントロールすることで、基質の分泌にどのような変化が生じるかを調べる。同様にHLF細胞等の細胞株を用いて、肺線維芽細胞におけるRab14およびCCN2の作用を検証していく。
II. Rab14とCCN2が、骨や肺組織の形成や疾患へ与える影響を解明する。
タモキシフェン誘導性に全身でCCN2を欠損させることができるコンディショナルノックアウトマウスおよびCcn2トランスジェニックマウスを用い、骨組織に見られる影響をマイクロCTにより解析することを考えている。また、これらのマウス由来の骨や肺組織切片で、Rab14とCCN2の局在を組織レベルで検出すると共に、CCN2の有無あるいは発現量の違いによるRab14の挙動や分泌タンパク質等の状態を組織レベルで調べる。これらの結果から、骨および肺組織における基質形成にCCN2、Rab14がどのような影響を及ぼすかを調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ほぼ計画通りに使用でき、残金が11,866円となった。必要な試薬を購入するには額が小さく、有効に使用できないと判断した。次年度の研究費と合算して、必要な試薬を購入することとした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
2017年度の研究費と合算して、キット試薬を購入することとした。
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