| 研究課題/領域番号 |
16K11798
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| 研究機関 | 松本歯科大学 |
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研究代表者 |
荒井 敦 松本歯科大学, 歯学部, 助教 (00532772)
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| 研究分担者 |
小林 泰浩 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 教授 (20264252)
山田 一尋 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (40182521)
溝口 利英 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 講師 (90329475)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 破骨細胞 / オートファジー / 破骨細胞前駆細胞 / Beclin 1 / LC3B |
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| 研究実績の概要 |
矯正力が誘導する骨改造において、破骨細胞は中心的役割を担うが、破骨細胞の誘導機構の詳細は不明である。我々は破骨細胞の誘導研究において、破骨細胞への分化が決定した前駆細胞(quiescent osteoclast precursors, qOP)を同定した(J Cell Biol 184: 541, 2009)。本研究は、矯正力によるqOPのオートファジー誘導機構を解明する。
Autophagyは細胞成分を代謝する主要分解機構であり、細胞の恒常性維持において重要な役割を担っている。 近年、細胞の分化、活性の過程においてAutophagyが関与することが報告されている。 破骨細胞においても、Autophagy関連遺伝子が欠損することで破骨細胞の骨吸収機能不全が起こることが明らかになった。 しかし、破骨細胞分化過程においてAutophagyがどのような役割を担っているかについてはいまだ不明な点が多い。 そこで我々は破骨細胞分化におけるAutophagyの役割について解析をおこなった。 ①野生型マウス由来の骨髄マクロファージ(M)へのRANKL刺激は、オートファゴソームの主要成分の一つであるLC3Bの発現を増加させた。 ②Autophagy活性の初期段階に必要とされるBeclin 1の発現についても解析したところ、RANKL刺激によりその発現が上昇した。 さらにMの細胞株であるRaw264.7細胞にBeclin 1を過剰発現させ、破骨細胞分化能について調べた結果、通常の細胞と比較し破骨細胞数は増加した。
これまでの結果より、RANKL刺激によるAutophagyの活性化は、Beclin 1により生じることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
破骨細胞分化におけるAutophagyの役割について解析をおこなった結果、in vitroにおいて、オートファゴソームの主要成分の一つであるLC3Bの発現をWestern Blottingにて解析をおこない経時的に発現量が増加していることを確認できた。
マクロファージの細胞株であるRaw264.7細胞にGFP-LC3Bベクターをインフェクションし、コンフォーカル顕微鏡を用い細胞内のLC3Bの発現を観察したところ、RANKL添加によりGFP陽性のLC3Bの発現上昇が確認できた。
次に、Autophagy活性の初期段階に必要とされるBeclin 1の発現についてもin vitro解析をおこなったところ、RANKL刺激によりその発現が上昇していた。そのため、Raw264.7細胞にBeclin 1を過剰発現させ、破骨細胞分化能の解析をおこなった結果、コントロール細胞と比較し破骨細胞数は増加していることを確認した。
これら骨髄マクロファージおよび細胞株Raw264.7細胞を用いたin vitro解析はおおむね順調に進展していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの研究結果により、破骨細胞分化過程におけるAutophagyの役割について解析をおこなってきた。その結果、RANKL刺激によるAutophagyの活性化は、Beclin 1により生じることが示唆された。
そのため、今後の研究の進捗方策として、RANKL刺激によるBeclin 1の発現上昇のメカニズムについての解析をおこなう予定である。LPS-TLR4シグナルによって、TRAF6が活性化することでBeclin1へUbiquitinチェーンが結合しAutophagyが活性化されることが報告されていることから(Shi C et al Science Signaling, 3, 42 2010)、RANK-RANKLシグナルによっても同様な現象が起こる可能性があると考え、RANKL刺激によるBeclin 1へのUbiquitinチェーンの結合の有無を解析する。さらに、免疫蛍光染色にて細胞レベルでの確認をおこなう。
in Vivo解析に関しては、Beclin 1のノックアウトマウスは胎生致死のため、ヘテロノックアウトマウスを用いて解析をおこなったが、野生型マウスと比較しても有意な差は確認できなかった。現在Beclin1のコンディショナルノックアウトマウスを作製中である。近日中にマウスの解析をおこなう予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計画していた物品を購入したが、予定金額より安価で購入できたため、3168円の差額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
差額である3168円は文房具の購入に当てる予定である。
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