| 研究課題/領域番号 |
16K11810
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
窪田 直子 鹿児島大学, 医歯学域歯学系, 助教 (40569810)
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| 研究分担者 |
佐藤 正宏 鹿児島大学, 医用ミニブタ・先端医療開発研究センター, 教授 (30287099)
稲田 絵美 鹿児島大学, 医歯学域附属病院, 助教 (30448568)
野口 洋文 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50378733)
齊藤 一誠 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (90404540)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 生体内遺伝子導入 / PiggyBacシステム / CRISPR/Cas9 |
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| 研究実績の概要 |
歯根の形成に関するメカニズムは、歯冠形成に比べて研究報告が少ない。もとより、ヒトの歯形成に関わる遺伝子の探索、その機能解明は、歯系分野では重要である。試験管内（in vitro）での遺伝子の機能解析は一般的だが、遺伝子を直接歯系組織に導入することにより、その効果を生体内（in vivo）で検討する行為は世界的に稀少である。本研究では、独自に開発した方法を用いて幼若マウスの歯根形成端周囲組織に遺伝子（DNA）を直接注入することで、歯根形成に重要とされるFGF-10やIGF-Iの機能をin vivoで模索することを第一の目標に据える。さらに、トランスポゾンを用いた導入遺伝子の宿主染色体への挿入による遺伝子発現の定着化、最近開発された次世代型KO技術による標的遺伝子のKOの可能性を探ることを第二の目標に据える。平成２８年度はpiggyBac（PB）トランスポゾンシステムによる遺伝子の長期持続発現に関する検討とCRISPR/Cas9システムによる標的遺伝子のKOに関する検討をin vitroで行った。
細胞に蛍光遺伝子を内蔵するトランスポゾンとPB transposase発現ベクターを共にelectroporation systemを用い、遺伝子導入を行った。その結果、効率的に遺伝子導入安定株が取得でき、且つ長期培養後も導入遺伝子が脱落せず、その発現が持続されることが示された。一方、Cas9とgRNA（dentin sialophosphoprotein [Dspp]遺伝子を標的としたguide RNA）を同時に発現するベクター ＋ Hygromycin B耐性遺伝子発現ベクターを歯髄細胞に共遺伝子導入した。遺伝子導入後、Hygromycin Bでセレクションし、濃縮株についてゲノム解析を行ったが、Dspp遺伝子に変異は認められなかった。現在、２回目の実験を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
一般的に遺伝子導入効率が高いとされるPBによる遺伝子導入法を初代歯髄細胞に適用した。細胞に蛍光遺伝子を内蔵するトランスポゾンとPB transposase発現ベクターを共にInvitrogen社のNeon electroporation systemを用い、遺伝子導入を行った。その結果、効率的に遺伝子導入安定株が取得でき、且つ長期培養後も導入遺伝子が脱落せず、その発現が持続されることが示された。
一方、Cas9とgRNA（dentin sialophosphoprotein [Dspp]遺伝子を標的としたguide RNA）を同時に発現するベクター ＋ Hygromycin B耐性遺伝子発現ベクター ＋ EGFP蛍光遺伝子発現ベクターを歯髄細胞に上記Neon systemを用い、共遺伝子導入した。１回目の実験では遺伝子導入後、Hygromycin Bでセレクション後、濃縮株についてゲノム解析を行ったが、Dspp遺伝子に変異は認められなかった。現在、２回目の実験を行い、CRISPR/Cas9システムによる標的遺伝子上の変異誘導効果について検討を行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
H２８年度に引き続き、CRISPR/Cas9システムによる標的遺伝子のKOに関するin vitroでの検討を継続する。in vitroでの標的遺伝子のKOが確認できた後には、Cas9とgRNA（FGF-10やIGF-I 遺伝子を標的としたguide RNA）を同時に発現するベクター ＋ EGFP発現ベクターを幼若（生後15日頃）B6C3F1メスマウスにGTPT法（gene transfer to peripheral tissues surrounding tooth：DNAの目的部位への注入と続くin vivo electroporationを用いて外部遺伝子を歯根形成端周囲組織に導入する方法）で導入し、その後、注入組織からゲノムDNAを精製し、目的遺伝子の標的となる塩基配列に塩基レベルでの変異が発生しているかを分子生物学的に調べる。一方、GTPTを用いてトランスポゾン系のベクターを導入後、注入組織における蛍光遺伝子の長期持続発現についても検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成２８年度はin vitroでの先行的研究が主体だったため、実際の支出が予算を下回る結果となった。平成２９年度以降は分子生物学的解析や組織標本作製を行う機会が増える見込であり、それらを実施するために必要な物品の購入に充てることとしたい。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成２９年度の研究費使用計画は以下の通りである。
物品費として細胞培養用試薬、分子生物学用酵素、大腸菌培養用試薬等の消耗品を、旅費として日本小児歯科学会、歯科基礎医学会学術大会の参加と研究打ち合わせを、謝金として研究補助の謝金を、その他として論文校正料、投稿料を計上した。
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