| 研究課題/領域番号 |
16K11843
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
山口 洋子 日本大学, 歯学部, 助教 (00239922)
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| 研究分担者 |
大島 光宏 奥羽大学, 薬学部, 教授 (30194145)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 初代培養上皮細胞 / 三次元培養 / 生体外歯周炎モデル / コラーゲン分解 |
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| 研究実績の概要 |
歯周炎の発祥・進展機構におよぼす歯肉上皮細胞の役割に関して、申請者らが開発した「生体外歯周炎モデル」を用いて解析を試みた。これまでは歯肉線維芽細胞と上皮細胞を組み合わせて三次元培養したゲルそのものをGeneChip解析してきた（Ohshima M et al., J Clin Periodontol, 2016）が、本研究ではゲルから上皮細胞層を剥離して、上皮層と線維芽細胞を含むコラーゲンゲル部分から別々にRNAを回収する手法を開発した。三次元培養開始１日目と４日目にこの方法を用いて上皮細胞層を回収してRNAを抽出し、GeneChip解析を行った。コラーゲン分解に伴って最も発現上昇していたのはRARRES1で、多くのがんでメチル化がみられるが未だ機能不明な腫瘍抑制因子で、α-tubulinの機能調節に関与しているようである（Sahab ZJ et al., Cancer Res 2011）。逆に最も発現低下が見られたのはC2CD3で、こちらは中心体の伸長への関与が報告されており、その変異は非常にまれな先天性形態異常である口腔顔面指趾症候群を招くと報告されている（Cortes CR et al., Sci Rep 2016）。両者の結果を考え合わせると、三次元培養「生体外歯周炎モデル」においてコラーゲン分解が起こる際、上皮細胞で起こっている変化は中心体のα-tubulin代謝異常であることが推測された。RARRES1は腫瘍抑制因子として報告されており、一見するとコラーゲン分解とは矛盾する結果のようであるが、C2CD3との関係を検索することで、その関係が明らかにできるのではないかと考えている。上皮は生体外からアクセス可能であるため、この代謝変化を調節する薬剤のスクリーニングを行うことによって、まったく新しい外用歯周炎治療薬が開発できる可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
予想よりも早く「生体外歯周炎モデル」から上皮層を剥離してRNAを回収する手法が確立できた。このサンプルのGeneChip解析により、数多くのコラーゲン分解にかかわる因子を抽出できた。概要に解析結果を記した遺伝子は最大と最小のみであるが、これが中心体の代謝で一致し、さらに口腔顔面指趾症候群という遺伝性疾患との関連性が示唆されたことは、予想外の大きな収穫であった。
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| 今後の研究の推進方策 |
コラーゲン分解に伴い、上皮細胞層において最も発現上昇したRARRES1と最も低下したC2CD3との関係を中心体におけるα-tubulin代謝を中心に検索し、これを調節する薬剤のスクリーニングを、最初は二次元培養でqPCRによる遺伝子発現変化をモニターすることで行い、効果のありそうな薬剤の評価は「生体外歯周炎モデル」を用いて行う。
さらにGeneChip解析において発現変化がみられたその他多数の遺伝子に関しては、それらの機能を調べるとともに、歯周炎関連線維芽細胞のMMP産生におよぼす影響を中心に検索していく。
また、可能であればmiRNAに関しても解析を行い、歯肉上皮細胞をターゲットとした歯周炎の遺伝子治療も視野に入れた研究を継続していきたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
消耗品等購入の際、値引きおよびキャンペーン等により残金が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
高発現が観察された遺伝子に関してはmiRNA inhibitorを、低発現であった遺伝子にはmiRNA minicを作製（外注）して、lipofectionを行う。これによりどのような遺伝子発現変化が生じるかをGeneChip解析（外注）する。さらにGene Ontology解析を行い、コラーゲン分解に伴う三次元培養における上皮細胞の代謝変化の概略知るための培養関連試薬を購入予定である。
なお、２８年度に生じた残金は、２９年度の消耗品費と併せて、培養用試薬等を購入予定。
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