| 研究課題/領域番号 |
16K11845
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| 研究機関 | 愛知学院大学 |
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研究代表者 |
三谷 章雄 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (50329611)
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| 研究分担者 |
菊池 毅 愛知学院大学, 歯学部, 准教授 (40421242)
尾関 伸明 愛知学院大学, 歯学部, 講師 (70469005)
茂木 眞希雄 愛知学院大学, 薬学部, 准教授 (00174334)
梅村 正幸 琉球大学, 熱帯生物圏研究センター, 准教授 (90359985)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | IL-35 / IL-17 / ヒト骨格筋幹細胞 |
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| 研究実績の概要 |
炎症や感染防御において注目されているTh17細胞から産生されるIL-17は、リウマチ患者の滑膜より検出され、RANKLを誘導することにより破骨細胞を介した骨吸収に関与していることも明らかとなっている。歯周病において、Th17細胞やTreg細胞の関与が示唆されており、歯周病病態におけるこれらT細胞や関連サイトカインの役割について更なる研究が必要である。主にTreg細胞より産生される抑制性サイトカインのIL-35は、コラーゲン誘導性リウマチを抑制すること、Th17細胞分化を抑制することが知られている。我々は、これまでに歯周病患者は健常者よりIL-35発現/産生が有意に高いことを報告してきているが、骨代謝および骨再生に関するIL-35の役割は未だ不明である。本研究では効率的な骨再生システムを模索するために、特に幹細胞から骨芽細胞の分化過程におけるIL-35の役割を明らかにすることを目的としている。
平成28年度は、BMP-2を用いたα7integrin陽性ヒト骨格筋幹細胞から骨芽細胞様細胞への分化誘導時におけるIL-35やIL-17の影響を検討する実験から始めているのだが、UCSF（Dr. Randall H. Kramer, Professor of Cell and Tissue Biology, School of Dentistry, UCSF, USA）から供与されたヒト骨格筋幹細胞の増殖培養の時点で苦慮した。同幹細胞を20%FCS含有Ham’s F10 Nutrient Mix培地にて培養を行ったところ、細胞のディッシュ（シャーレ）上での定着および細胞増殖に関して、不具合が生じている。予定外ではあるが、最適な条件を再設定する必要があるため、細胞培養の各種条件（FCSの使用ロット等）を見直しており、ある程度の良好な条件が設定できてきたため、次年度は引き続き、遺伝子発現解析等の実験を進める予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成28年度はUCSF（Dr. Randall H. Kramer, Professor of Cell and Tissue Biology, School of Dentistry, UCSF, USA）から供与されたヒト骨格筋幹細胞を用いて、骨芽細胞に分化培養し、IL-35やIL-17を添加して遺伝子発現の変化等を解析していく予定であった。しかしながら、予定外ではあるが、供与されたヒト骨格筋幹細胞の増殖培養の時点で、ディッシュ（シャーレ）上での細胞の定着および細胞増殖に関して、不具合が生じ苦慮した。そのため、最適な培養条件を再設定する必要性が発生し進捗が遅れた。
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| 今後の研究の推進方策 |
供与されたヒト骨格筋幹細胞の培養条件に関して、何度も試行錯誤して再設定してきた結果、FCSの使用ロット等の添加因子等の培養時条件を見直し、ある程度の良好な条件が設定できてきている。また、培養条件に関しては、特に生体環境を踏まえて細胞培養に用いるディッシュをTypeⅠcollagenコーティングすることで、より細胞が増殖・分化しやすい環境も模索している。さらに、細胞の遺伝子発現動態や細胞の挙動は細胞外の微小環境により細やかに制御されていることから、より生体内に近い微少環境を再現するため、ハンギングドロップ法（培養ディッシュの蓋の内面で細胞懸濁液の液滴を懸垂させ、液滴あたりに一つの細胞塊を形成する）で細胞塊を作製し、その後各種リコンビナントタンパク質を加えることで細胞増殖能等の解析も行ってみる予定である。次年度は、上記の如く様々な培養条件にて、遺伝子発現解析等の実験を行い、安定的なデータ獲得が出来るか否かの確認を確実に行った上で、本研究を進める予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
UCSFから供与されたヒト骨格筋幹細胞を用いて、骨芽細胞に分化培養し、IL-35やIL-17を添加して遺伝子発現の変化等を解析していく予定であったが、ヒト骨格筋幹細胞の増殖培養の時点で、ディッシュ（シャーレ）上での細胞の定着および細胞増殖に関して、不具合が生じ苦慮した。そのため、最適な培養条件を再設定する必要性が発生し、実験計画が滞ってしまっているため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
供与されたヒト骨格筋幹細胞の培養条件に関して、何度も試行錯誤して再設定してきた結果、ある程度の良好な条件が設定できてきている。また、培養条件に関しては、特に生体環境を踏まえて細胞培養に用いるディッシュをTypeⅠcollagenコーティングすることで、より細胞が増殖・分化しやすい環境も模索している。さらに、細胞の遺伝子発現動態や細胞の挙動は細胞外の微小環境により細やかに制御されていることから、より生体内に近い微少環境を再現するため、ハンギングドロップ法で細胞塊を作製し、その後各種リコンビナントタンパク質を加えることで細胞増殖能等の解析も行ってみる予定である。次年度は、上記の如く様々な培養条件にて、遺伝子発現解析等の実験を行い、安定的なデータ獲得が出来るか否かの確認を確実に行った上で、本研究を進める予定である。遅れてしまった実験は次年度において行うため、生じた次年度使用額はそれに充当する。
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