研究課題
当初計画した実験はすべて完了し、研究目的達成のための複製ポリメラーゼの変異株（２種類）をヒト細胞から作製した。国際共同研究の相手（T. Carr教授）は、この変異株を使いDNA複製起点を同定する実験を未だ始めていない。DNA複製起点をゲノム全体で同定する手法は酵母で開発された。この手法では、複製ポリメラーゼ（Polδ、Polε）に変異を入れた酵母変異株を使った。Polε変異株はリーディング鎖合成された鎖にrNTP（RNAの先駆ヌクレオチド）を大量に取込み、Polδ変異株はラギング鎖合成された鎖にrNTPを大量に取込む。取込ませた後にゲノムDNAを精製する。ゲノムDNAの、rNMPを取込んだ部位はアルカリ処理で切断される。断片化したDNA鎖の塩基配列を決定することによって、どの断片がリーディング鎖合成もしくはラギング鎖合成されたかが分かる。Crick鎖を5’から3’の方向に調べた時に、リーディング鎖合成の鋳型であったDNA鎖が急にラギング鎖合成されるように転換した部位が複製起点である。我々は、当初、上記酵母の実験と同じ変異を、ヒト細胞に導入したが、この変異株は致死であった。そこで実験手法を以下のように変更した。校正ヌクレアーゼを不活性化する点変異をPolδ遺伝子とPolε遺伝子とに導入したヒト細胞を創った。この校正変異株を高濃度Ara-C（核酸アナログの抗がん剤）に１時間曝露する。この手法により、細胞の生存率を損ねることなく、Polε校正変異株にはリーディング鎖合成された鎖にAra-CMPを高密度に取込ませ、Polδ校正変異株にはラギング鎖合成された鎖にAra-CMPを高密度に取込ませることができた。Ara-CMPを取込んだ部位もアルカリ処理で切断されるので、断片化したDNA鎖の塩基配列を決定することによって複製起点がゲノム全体で決定できる。
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Oncotarget
巻: 8 ページ: 33457-33474
10.18632/oncotarget.16508
