| 研究実績の概要 |
本研究はDNA複製に不可欠なATRキナーゼの役割の解明を目的とし、DNA複製に応答するリン酸化因子を解析した。当初計画していたSV40 genome DNA in vitro複製系の構築に関しては、SV40 ウイルスT抗原によるDNA複製進行をin vitroで再現することに成功したが基質検出に必要とされる利用可能なSV40 ウイルスT抗原量に限りがあること、および基質回収率が低いことから質量分析に十分なサンプルを得られなかった。そこで本研究では当初の予定を変更し細胞内におけるリン酸化基質を同定することとした。外的刺激非存在下における正常細胞のDNA複製に関連したリン酸化基質を同定するため、正常肺上皮細胞（SAEC）を用いた。またがん遺伝子誘発性の内因性DNA複製ストレス応答を解析するため、変異型K-Rasを正常肺上皮細胞に導入し形質転換を誘導する肺腺がんモデルを構築した。これらの細胞においてATR高発現細胞およびATR阻害剤を用いることによってATR依存性のリン酸化イベントを抽出した。同定されたリン酸化サイトのうちATR阻害剤存在下による変動を算出、主成分解析およびIPA解析を行ったところ、予想されたDNA損傷応答（Role of BRCA in DNA damage response, NER pathway, Cell cycle G1/S checkpoint regulation , Cell cycle G2/M checkpoint regulation）に関連するpathwayに加えてRhoAシグナリングおよびクロマチンリモデリングに関与するpathwayが検出された。これらのことから内因性DNA複製ストレス応答におけるATRは外的要因によるDNA損傷応答時とは異なる基質群をリン酸化することにより染色体を安定に維持し細胞の生存を維持することが示唆された。
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