| 研究課題/領域番号 |
16K12707
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| 研究機関 | 宮城大学 |
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研究代表者 |
菰田 俊一 宮城大学, 食産業学部, 准教授 (50404843)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | エビ / アレルギー / メイラード反応 |
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| 研究実績の概要 |
はじめに市販のブラックタイガー種のエビをリン酸緩衝液中で煮沸し、耐熱性のアレルゲンタンパク質を抽出した。次に、この粗タンパク質を疎水クロマトグラフィーやイオン交換クロマト等を用いて精製し、目的のアレルゲンタンパク質(トロポミオシン、37 KDa)を得た。続いて、このアレルゲンタンパク質を還元糖と共に加熱して、メイラード反応を進めた。用いた糖類は、単糖類のグルコースとリボース、多糖類のガラクトマンナンとした。反応条件を検討したところ、単糖類を用いた場合には、7時間程度の加熱で十分であったが、多糖類を用いた場合には、3－7日間の反応が必要であった。続いて、糖修飾したアレルゲンタンパク質の抗体反応性をウェスタンブロッティングにより、確認した。その結果、グルコースを用いた場合には、効果はみられななかったが、リボースを用いた場合には、抗体反応性の抑制効果が確認された。一方で、多糖類のガラクトマンナンを用いら場合には、別の問題が発生した。メイラード反応により、タンパク質の修飾を行ったところ、水に対して不溶化し、その後の電気泳動や精製作業が困難になってしまった。現在、反応条件の設定や溶解の試薬の検討などを進めている。また、グルコースを構成単位としたオリゴ糖についても、メイラード反応およびウェスタンブロッティングによる評価を行ったが、単糖類と同様の結果となった。
その他、メイラード反応以外の方法として、酵素を使った方法による低アレルゲン化についても検討に着手した。使用した酵素はトランスグルタミナーゼであるが、現在条件設定等の作業を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
概ね計画通りの進捗であったが、一部当初予測できなった事態も発生し、やや計画が遅れている。
メイラード反応による低アレルゲン化の取り組みについては、単糖類を用いた検討において、予想通りの結果を確認し、特にリボースを用いた場合に、抗体反応性の抑制効果を示し、低アレルゲン化の可能性を示すものであった。一方で、多糖類のガラクトマンナンについては不溶化を招き、現在、対応策を検討している。対応策については、研究協力者にも協力を求めている。また、現状ではタンパク質の精製に関して十分にノウハウを蓄積できていないため、メイラード反応前後でのタンパク質精製部分で時間を要している。
酵素による低アレルゲン化に関する取り組みの中で、先ずはトランスグルタミナーゼを用いた取り組みを始めたが、予想した反応物が得られない状況が続いている。現在、反応条件の検討などを行っているが、場合によっては、別の酵素などを検討した方が良い可能性がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、メイラード反応の条件検討を進めている。また、動物レベルの評価を行うため、準備を進めている。メイラード反応は、単糖類を用いた場合は十分に進み、抗体反応性についても評価が進んでいるので、条件検討の中心は多糖類を用いた場合となる。タンパク質と多糖類の比率や反応時間、反応温度などを検討することにより副生成物の生成を抑制し、目的の多糖類-タンパク質複合体を得ることができる。また、この複合体を誘拐する際の溶液を工夫し、その後の精製や解析に進むことができる。タンパク質の精製法についても、現在ノウハウを蓄積しつつある。また、これらと平行して、動物レベルの試験を行うための予備的な試験として、マウスにアレルゲンタンパク質を投与して、アレルギー化している。アレルギー化は、血中IgG, IgEの測定を行う。発症の評価に関は、アレルゲン投与時の血中ヒスタミン量によって行う。
一方で、研究協力者の協力を得て、遺伝子組み換え型のアレルゲンタンパク質を用いた試験も行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初、試験管レベルの試験が順調に進んだ場合、これに続きマウスを用いた動物試験について予備的な試験を行い、本試験に備える予定であったが、試験の中で対応すべき項目が発生したため、マウスの導入や飼育試験に伴う評価などが次年度に延期になった。このことから関連予算の執行を次年度以降に延期することとした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
当初H29年度に予定していた、動物試験の実施と、H28年度に解決できなかった、反応条件の設定、また、タンパク質の精製などを同時に実施する。また、これに関する予算を執行する。
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