| 研究課題/領域番号 |
16K12730
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| 研究機関 | 岩手医科大学 |
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研究代表者 |
東尾 浩典 岩手医科大学, 教養教育センター, 講師 (50342837)
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| 研究分担者 |
齋野 朝幸 岩手医科大学, 医学部, 教授 (40305991)
吉田 潤 岩手医科大学, 教養教育センター, 助教 (20611007)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | マスト細胞 / 調節性分泌 / 即時型アレルギー / 蛍光プローブ / プレートリーダー |
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| 研究実績の概要 |
花粉症などの即時型アレルギーは、マスト細胞の分泌顆粒中の化学伝達物質が開口放出（脱顆粒）されることが引き金となる。それゆえ、脱顆粒を抑制する物質の探索・同定には大きな社会的ニーズがあると考えられ、本研究では、脱顆粒制御物質の探索に資する多検体解析が容易な脱顆粒評価法の構築を、脱顆粒イメージング技術に立脚して試みている。
[1] 前年度、pH感受性蛍光プローブ（酸性条件下で蛍光を発し中性条件下で蛍光が消失する）を用いて分泌顆粒を蛍光ラベルし、脱顆粒による蛍光強度減少（中性の細胞外液に触れることによる）を定量する系を作成した。本年度は、脱顆粒関連遺伝子の過剰発現あるいはノックダウンによって脱顆粒度合を様々に変化させ、この系の検証を行った。その結果、この系の感度は従来のβ-ヘキソサミニダーゼの酵素活性を指標とする生化学的評価系よりも優れていないことが明らかになった。その後、分泌顆粒をラベルする数種類の蛍光プローブを検討したが目立った改善は見られなかった。
[2] 前年度、分泌顆粒内の基質との相互作用で蛍光を発するプローブを細胞外液に添加し、脱顆粒による蛍光強度増強（細胞膜との融合により分泌顆粒内部へ細胞外液が侵入することによる）を定量する系を作成した。本年度は、[1]と同じ手法で、この系の検証を行った。その結果、この系の感度は従来の生化学的評価系よりも優れていることが明らかになった。しかし、このプローブが発する蛍光は非常に強く、強い分泌刺激のもとでは継時的測定中に蛍光強度が飽和する。この問題を別の蛍光プローブを用いて緩和することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
分泌顆粒をラベルする蛍光プローブを用いた脱顆粒評価系（上記[1]）、細胞膜と融合した分泌顆粒をラベルする蛍光プローブを用いた評価系（上記[2]）ともに、系の改善・最適化へ向けそれぞれ数種類の蛍光プローブを試す必要性が生じ、これに予想以上の時間を費やした。また当初、スクリーニングの信頼性向上に資することを目的として2種類の蛍光プローブを同時に用いた脱顆粒評価系の構築を企図していたため、蛍光プローブの相性を考えながらの作業であったことも、時間を費やす要因となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
脱顆粒評価系は、分泌顆粒をラベルする蛍光プローブを用いる系（上記[1]）が思わしくないため、細胞膜と融合した分泌顆粒をラベルする蛍光プローブを用いる系（上記[2]）に一本化する。これと適切なCa2+感受性蛍光プローブとを組み合わせて、細胞内Ca2+濃度変化と脱顆粒度合を同時評価できる系を作成し、様々な遺伝子の過剰発現あるいはノックダウンで得られる蛍光強度変化パターンをプロファイルする。その後、既に作用メカニズムが判っている化合物を用いて、この評価系の実用性を検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）
２通りの脱顆粒評価系（上記[1], [2]）の構築に拘ったため、Ca2+感受性蛍光プローブとの組み合わせや、化合物を用いた検証に未だ着手できていないため、残額が生じた。
（使用計画）
これから着手するCa2+感受性蛍光プローブとの組み合わせや、化合物を用いた検証に用いる。
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