2016 年度実施状況報告書

蛍光画像サイトメトリによる高速腸内細菌叢プロファイリングとディスバイオーシス予測

研究課題

研究課題/領域番号	16K12909
研究機関	東京大学
研究代表者	太田禎生東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 客員研究員 (70731214)
研究期間 (年度)	2016-04-01 – 2018-03-31
キーワード	フローサイトメトリー / 細菌分類
研究実績の概要	現在の細菌解析法は、菌叢を総体として塩基配列を解読するメタゲノム手法が主流となっていますが時間・コストがかかり、遺伝情報から機能理解の間にギャップを残すため、より安価・高速で１細菌から総合的に聖地解析できる技術が求められています。本研究では、高速蛍光画像サイトメトリーを用い、腸内細菌画像プロファイリングによる１細菌動態解析を、個体データと統合的に組み合わせ、細菌層解析から、個体動態予測を目指して来ました。当該年度に行った研究成果により、菌叢の高速イメージングに成功し、分類を開始しています。具体的には、細菌には核酸染色を行って蛍光ラベルし、高倍率の対物レンズを適用した高速蛍光イメージングサイトメトリー技術を適用し、微小な細菌の高速イメージングを実現しました。一方で信号の弱さと解像度の不足に際し、標識を要さない新たな一細菌分類蛍光サイトメトリー技術を開発しました。各細菌が含有する多様な分子の差異から、それぞれユニークな細菌種によって特異的に有する自家蛍光スペクトルに注目しました。マイクロ流体技術を用いて細菌を流路中で整列し、集光した励起光を照射し、発された微弱な蛍光を分光し、ライン型光検出素子を用いて計測しました。計測した蛍光スペクトルに対して機械学習分類を適用し、細菌種をラベルフリーで分類することに成功しています。本自家蛍光フローサイトメトリー技術開発に際し、環境細菌を専門とする研究者と共同研究を開始しています。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由当該年度に行った研究成果により、菌叢の高速イメージングに成功し、分類を開始しています。具体的には、細菌には核酸染色を行って蛍光ラベルし、高倍率の対物レンズを適用した高速蛍光イメージングサイトメトリー技術を適用し、微小な細菌の高速イメージングを実現しました。一方で信号の弱さと解像度の不足という課題に直面しました。そこで、標識を要さない新たな一細菌分類蛍光サイトメトリー技術に着想し、開発に成功しました。各細菌が含有する多様な分子の差異から、それぞれユニークな細菌種によって特異的に有する自家蛍光スペクトルに注目しました。マイクロ流体技術を用いて細菌を流路中で整列し、集光した励起光を照射し、発された微弱な蛍光を分光し、ライン型光検出素子を用いて計測しました。計測した蛍光スペクトルに対して機械学習分類を適用し、細菌種をラベルフリーで分類することに成功しています。本自家蛍光フローサイトメトリー技術開発に際し、環境細菌を専門とする研究者と共同研究を開始しています。
今後の研究の推進方策	今後の研究では、高速蛍光イメージングフローサイトメトリーと、高速自家蛍光スペクトルフローサイトメトリー技術を、１細菌迅速解析の、より高次な個体や環境システムへの予測に向けて、応用していきます。そのためにも、両サイトメトリー技術のソーティング技術実装を推し進めます。具体的には、計測データをリアルタイム処理し、マイクロ流路中で細菌を微小液滴に包み、分取を行います。これにより、分類した細菌叢を16S rRNA解析にかけ、フローサイトメトリー分類の実効性、および分類の生物学的意義を検証します。最終的には、個体や環境動態と、１細菌動態プロファイリングを統合的に解析し、基盤評価法開発を目指します。
次年度使用額が生じた理由	予算調整のため
次年度使用額の使用計画	光学備品、消耗品を購入。