| 研究課題/領域番号 |
16K12916
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| 研究機関 | 東京薬科大学 |
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研究代表者 |
根岸 洋一 東京薬科大学, 薬学部, 准教授 (50286978)
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| 研究分担者 |
吉川 大和 東京薬科大学, 薬学部, 准教授 (20274227)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 抗体 / 超音波 / リポソーム |
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| 研究実績の概要 |
前年度検討で用いたリポソームへの抗体修飾のためのリンカーペプチド（proteinA結合性ペプチド）よりも更にFcドメインと高い結合活性が期待されるリンカーペプチド（proteinG結合性ペプチド）を用いてマレイル化PEGリポソームと反応させ、リンカーペプチド修飾PEGリポソームとした。さらに抗HER2抗体を添加混合する簡便な手法で抗体修飾リポソームの調製を行い、HER2高発現細胞へのリポソームの取り込み能を蛍光顕微鏡にて評価したところ、効率的な取り込みが観察された。以上のことから、proteinA結合性ペプチドと同様にproteinG結合性ペプチドを利用した場合でも、簡便なリポソームの抗体搭載が可能となることが示された。
さらに抗がん活性の増強を期待して、ドキソルビシン内封リポソームへの抗HER2抗体修飾を行い、細胞障害性をMTTアッセイにて評価した結果、未修飾に比べ、抗体修飾群において顕著な障害活性が認められたことから、本抗体修飾法の有用性が示された。次に抗HER2抗体搭載リポソームのバブル化の可能性を明らかにするために、調製した抗HER2抗体搭載リポソームに超音波造影用ガス（パーフルオロプロパンガス）を封入したところ、平均粒子径約500 nmのバブルリポソームが作製できた。細胞相互作用性を蛍光顕微鏡にて調べたところ、蛍光ラベルした抗HER2抗体搭載バブルリポソームは、HER2高発現細胞に安定に細胞表面に結合できることが示された。また、抗体搭載は、リンカーペプチド修飾バブルリポソームの調製後でも可能となることも明らかとなった。以上のことから、リンカーペプチドを利用することで、抗体のターゲティング能を維持した状態で簡便に超音波応答性の抗体搭載バブルリポソームを調製できることが示された。本手法は、様々な抗体搭載バブルリポソームの開発にも有用となることが期待される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度は、抗体搭載リポソーム調製法の更なる条件検討を行った。はじめにproteinG結合性ペプチドを用いて、in vitro実験にて抗体修飾効率を検証したところ、proteinGでも抗HER2抗体のリポソーム修飾が簡便に行えることが示された。さらに受容体へのターゲティング能を維持した状態で簡便に抗体搭載バブルリポソームの調製に成功した。これらの結果は、種々の細胞膜受容体を標的化するマウス・ラット由来IgG抗体を用いても、簡便にリポソームやバブルリポソームへの抗体修飾が可能となることを示唆している。以上より、本研究は順調に進捗していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度計画では、抗体搭載リポソームおよびバブルリポソームの有用性評価を進める。
１. 抗体搭載バブルリポソームの安定性評価
抗体搭載バブルリポソームの安定性を明らかにするため、超音波造影ガスを抗体搭載リポソームに内封した後に、ディッシュに調製したバブルリポソームを添加し、超音波診断イメージング装置を用い、経時的な超音波エコーシグナルを指標に評価する。また、それぞれ調製したバブルリポソームの粒子径の変動や、異なる周波数の超音波を照射した後の崩壊性の評価も行う。
2. ２．in vivoにおける抗体搭載リポソームの体内動態特性評価
蛍光ラベル化した抗体搭載リポソームあるいはバブルリポソームを担がんモデルマウス（HER2高発現がん細胞移植）に静脈内投与し、体内でのリポソームまたはバブルリポソームのin vivo蛍光イメージング装置にて、安定性を超音波診断イメージング装置にて評価する。リポソームへの抗体搭載には、抗HER2抗体を用いるが、簡便な抗体修飾技術の応用性を広げるために、新生血管標的化抗体などの修飾も試みる。ヒト血管内皮細胞などを用いた実験で細胞相互作用性を認めた場合に、上記と同様に担がんマウスでの体内動態評価を行う。また、蛍光ラベル化した抗体搭載リポソームあるいはバブルリポソームの腫瘍内分布を組織学的観点から評価する。
３．治療用超音波照射併用する抗体デリバリーシステムの確立－次にがん治療における治療用超音波併用抗体デリバリーシステムの有用性を評価するために、抗体搭載バブルリポソームを担がんモデルマウスへと投与した後に、体外からの治療用超音波照射を行い治療効果を検証する。診断と治療の融合（Theranostics）システムの可能性についても検証する。また、治療効果が低い場合には、抗がん作用を高めた抗体の調製、抗体搭載量を増やす工夫や、抗がん剤の内封等を試み、治療効率の改善を図る。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
(理由)研究計画は、ほぼ予定通り進み、proteinGに対する結合性ペプチドを利用することで、proteinA結合性ペプチドと同様に簡便なリポソームの抗体修飾が可能となることが示された。しかしながら、種々の細胞膜受容体を標的化するマウス・ラット由来IgG抗体を用いた場合での有用性評価までに至らなかったために、その分の試薬が未使用額となった。
(使用計画)次年度使用計画として、簡便な抗体修飾技術の応用性を広げるために、がん組織における新生血管をターゲット可能な抗体（マウス・ラット由来IgG抗体）などの修飾も試みる。さらにこれらを利用した担癌モデルマウスにおける体内動態評価を行う。これらの研究進捗を図るために使用する予定である。
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