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2016 年度 実施状況報告書

Nanodiscとセルフリー合成系による創薬基盤技術の構築

研究課題

研究課題/領域番号 16K13096
研究機関東京工業大学

研究代表者

車 兪徹  東京工業大学, 地球生命研究所, 特任准教授 (40508420)

研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード抗体医薬 / 試験管内選択 / 無細胞タンパク質合成系 / GPCR
研究実績の概要

抗体医薬は、従来の低分子医薬とは異なり、身体が持つ免疫システムを利用し、ガン細胞など特定の細胞を狙い打ちする画期的な医薬品である。本研究の狙いは、抗体作製に関わる主要プロセスを全てin vitroで行い、ハイスループット化によるシステマティックな生産・解析基盤を構築することである。
Nanodiscを調製するため、membrane scaffold protein 1(MSP1)(HisTag付き)をアフィニティークロマトグラフィー、及びゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。この精製産物を、リン脂質と界面活性剤存在下で混合した後、界面活性剤濃度を低下させることで、Nanodiscを自己集合的に形成させた。最後に再びゲル濾過カラムを通すことで純度の高いNanodiscを調製した。最終精製したNanodiscを280nmの吸光度から濃度を定量した。調製したNanodisc(ND)を無細胞タンパク質合成系に投入し、ND存在下でモデル受容体膜タンパク質であるbacteriorhodopsin(bR)を合成した。合成後、NiNTAマグネットビーズで処理することで、Nanodiscを反応液中から単離した。これをさらにanti-HAtag抗体マグネットビーズで処理することで、bRを含んだNanodiscのみを単離した。またbRが膜上で正しい立体構造を維持し多ことを示唆する呈色反応が観察された。
ランダム配列を持つライブラリーの作成するため、mRNAディスプレイ用と、リボソームディスプレイ用の27アミノ酸のランダム配列を含む鋳型DANをデザインした。これまでに、ライブラリー投下による無細胞系内でのペプチド合成と反応液からの単離に成功している。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

抗原となる、bRのin vitro合成と、2種のタグによる2ステップの単離精製には成功した。しかし抗体配列のプールとなるランダム配列の操作について、当初考えていたよりも時間がかかっている。用いる手法として、mRNAディスプレイとリボソームディスプレイを採用しているが、前者に関してはin vitro転写後のタグ配列の付加効率と翻訳産物の同定について、後者に関してはランダム配列のベクターへのligation効率とゲルからの切り出し効率について多くの条件検討を繰り返している。mRNAディスプレイ系に関しては、しかしながら、合成産物の同定と、反応液からの単離に成功した。
これらの結果から、本研究は概ね順調に進展していると言える。

今後の研究の推進方策

無細胞タンパク質合成系により得られたランダム配列と、先に合成したbRナノディスクを混合し、bRに特異的に結合する配列を選択する。使用しているマグネットビーズに非特異的に結合するmRNAが確認されたたため、デコイのRNAにより前処理をおこなうことで、これらの非特異結合を軽減することを狙う。
また、リボソームディスプレイ法に関しても、ライゲーション効率と切り出し精製効率の向上化を目指し、無細胞系によるランダム配列合成が行える状況を目指す。

  • 研究成果

    (6件)

すべて 2017 2016 その他

すべて 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 1件、 査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 図書 (2件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] What can synthetic biology offer to artificial intelligence (and vice versa)?2017

    • 著者名/発表者名
      Damiano Luisa, Kuruma Yutetsu, Stano Pasquale
    • 雑誌名

      Biosystems

      巻: 148 ページ: 1-3

    • DOI

      10.1016/j.biosystems.2016.09.005.

    • 国際共著
  • [雑誌論文] 無細胞タンパク質合成系の高度化と合成生物学への展開2017

    • 著者名/発表者名
      金森 崇,杉本(永池) 崇,車 兪澈,網藏 和晃,上田 卓也
    • 雑誌名

      Journal of Japanese Biochemical Society

      巻: 89(2) ページ: 211-220

    • DOI

      10.14952/SEIKAGAKU.2017.890211

  • [雑誌論文] 車 兪澈,上田 卓也2016

    • 著者名/発表者名
      膜タンパク質の無細胞合成法
    • 雑誌名

      生物物理

      巻: 56(3) ページ: 162-164

    • DOI

      10.2142/biophys.56.162

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [図書] 人工細胞の創製とその応用2016

    • 著者名/発表者名
      車 兪澈
    • 総ページ数
      215
    • 出版者
      CMC出版
  • [図書] 実験医学2016

    • 著者名/発表者名
      車 兪澈
    • 総ページ数
      139
    • 出版者
      羊土社
  • [備考] YUtetsu Kuruma website

    • URL

      http://gncd.jp/yk_test/index.html

URL: 

公開日: 2018-01-16  

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