2016 年度実施状況報告書

糖鎖還元法を用いた病原体検出金ナノ微粒子の大量合成技術

研究課題

研究課題/領域番号	16K13621
研究機関	埼玉大学
研究代表者	小山哲夫埼玉大学, 総合技術支援センター, 技師 (20375588)
研究分担者	松岡浩司埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (40272281)
研究期間 (年度)	2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード	糖鎖工学 / 金ナノ微粒子 / O157:H7
研究実績の概要	本研究課題は金ナノ微粒子表面に糖鎖構造を効率的に導入する手法を確立することを目的としている。平成２８年度は主として糖鎖の合成と糖鎖導入に関する研究を行なった。合成した糖鎖は病原性大腸菌O157:H7が産生するベロ毒素と結合する『グロボ3糖』をターゲットとした。当初予定していたノロウィルスが認識するH抗原の誘導体についてはグロボ3糖の大量合成に思いのほか手間取ったため、当該年度での合成を見送った。糖鎖合成と平行して金ナノ微粒子の合成条件についての検討を行なった。本研究における「表面に糖鎖が導入された金ナノ微粒子」の合成反応は、四塩化金酸の水溶液に糖鎖誘導体を溶解させてアルカリ条件にするという非常に簡便なものである。しかし、各材料の混合比や濃度などの合成条件を僅かに変えるだけで、生成した微粒子の直径や糖鎖密度の結果が全く異なることが経験的に明らかとなっており、これらの反応条件に関して検討を行い、所定のサイズの微粒子を安定的に生成できる「法則」を見いだすことも目標に掲げた。さらに、完成した金ナノ微粒子に対し「リン酸－フェニルヒドラジン法」を用い、微粒子表面糖鎖を酸化させてできた代謝物をHPLCと蛍光ディテクターを組み合わせて検出することにより、微粒子表面の糖鎖の量を分光学的に計測する。導入された糖鎖の量を基に、糖鎖誘導体導入反応における「糖と塩化金酸の混合比率」や反応溶液全体の濃度を変化させ、再度導入反応を行う。これを繰り返すことにより最も多くの糖鎖誘導体が導入される反応条件を見いだすことも目標とした。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由「研究実績の概要」で触れたように、グロボ3糖の大量合成に思いのほか手間取ったため、全体がやや遅れ気味である。これは糖鎖合成プロセスの簡略化と収率向上を企図して従来の合成方法から変えたものの、却って収率の低下が起こってしまい、結局元の合成方法に戻すというような過程を経たためである。このため、グロボ3糖を原料に用いた金ナノ微粒子の合成を何度も繰り返すことができなくなり、金ナノ微粒子合成反応を仕込む際の糖鎖と塩化金酸の混合比率並びに生成する金ナノ微粒子の直径との相関関係を見出すことも遅れが出ている。現在、元の反応プロセスでグロボ3糖の大量合成を継続している。前述のような状況であるが、糖と塩化金酸の混合比率および生成する金ナノ微粒子の直径に関しては、大体の相関関係が見出せるようになった。ただ、当初の方針では金ナノ微粒子の長期安定性を視野に入れて『可能な限り微小の粒子』を目指して10 nm前後の微粒子が最良であると想定していたが、イムノクロマトグラフに利用される金ナノ微粒子のサイズに関する実勢(50 nm前後)と小さすぎる微粒子は精製が困難である点を考慮して、最適化する微粒子の直径を当初よりも大きくする方針に変えた。金ナノ微粒子表面に導入される糖鎖誘導体の密度であるが、現在まで得られている知見では同じ反応条件で合成反応を仕込んでもロットごとにばらつきがあり、法則性が見いだせていない。こちらは当初の目的が病原体検査キットに使用可能な糖鎖含有金ナノ微粒子の合成であるため、品質管理的な意味合いも込めてさらなる検討が必要である。
今後の研究の推進方策	平成２９年度は前年の糖鎖導入反応の条件検討と並行し、金ナノ微粒子の「精製法」と「長期安定性」に関して検討する予定である。その一方で糖鎖の大量合成について遅れが見られるので、糖鎖誘導体の合成ならびに金ナノ微粒子の合成条件検討に関しても継続する。合成した微粒子の精製に関しては、今まで遠心分離で微粒子を沈殿・回収させる方法で行ってきた。これは金ナノ微粒子の溶液に対して加熱濃縮や凍結乾燥を行うと、微粒子同士の『凝集』が起こって粒子サイズが大きくなり、水溶液への再度の溶解・分散が難しくなることが経験的に明らかとなっているためである。しかしその一方で、ナノサイズの微粒子を遠心分離で沈殿させるには回転数を上げざるを得ず、装置の関係からスケールアップが難しくなるという問題がある。その問題に対して、溶液の密度勾配を利用して金ナノ微粒子を沈殿・回収する手法について検討を行う。具体的には、塩やアルコールを加えた水を少量加えて軽く遠心分離することにより、遠心分離の容器内部に溶媒の密度勾配を生じさせ、微粒子の沈殿・回収を行うものである。金ナノ微粒子が凝集して水溶性が低下した場合、再度の分散が困難となる。この問題に対しては、微粒子の水溶性向上と分散安定性を確保することにより対応する。具体的には長鎖アルキルとエチレングリコール鎖からなる界面活性剤を金ナノ微粒子に結合させて水中安定性が増した結果、微粒子同士の凝集が防げるというものである。分散安定性の向上は様々な温度で長期定温保管した際の凝集の度合いによって評価し、吸収スペクトルなどの分光学的手法や、直接光散乱を用いて微粒子のサイズを直接観測することにより検討する。
次年度使用額が生じた理由	物品費が当初予定より少なかった理由は、凍結乾燥機などの大型設備備品を購入しなかったことが挙げられる。また消耗品費については、糖鎖合成で滞りが見られたため、その先のプロセスで使用する「糖鎖活性を確認するためのレクチン」など、高価な試薬を購入するのを控えていたためと、既存の試薬を有効活用できたことが理由である。実験器具についても同様に、既存のものを可能な限り利用して新規購入をしなかった事が挙げられる。さらに、旅費が大幅に少なかった点に関しては、当初参加を予定していた平成２８年度の国際糖質学会(7月アメリカ・ルイジアナ州)ならびに日本糖質学会の開催スケジュールが業務と合わず、参加を見送ったためである。
次年度使用額の使用計画	物品費に関しては、平成２９年中に設備備品を購入すると共に、レクチンや比較対照としての市販の金ナノ微粒子など高価な試薬を多数購入の予定であり、見込み通りの支出の予定である。また、旅費に関しては平成２９年７月の日本糖質学会年会における学会発表において支出の予定であり、国際学会に関しては現段階で予定がないものの成果がまとまり次第、海外で発表を行うものとする。さらに人件費・謝金についても、論文としてまとまった後に英文校閲にて支出の予定である。