| 研究課題/領域番号 |
16K14333
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| 研究機関 | 東北学院大学 |
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研究代表者 |
宮内 啓介 東北学院大学, 工学部, 教授 (20324014)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ヒ素 / ヒ酸 / 亜ヒ酸 / バイオセンサー / Rhodococcus |
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| 研究実績の概要 |
土壌由来の細菌であるRhodococcus erythlopolis IAM1399株のヒ素耐性遺伝子群破壊株（以下Δars株）を用いて亜ヒ酸検出系を構築した。Δars株は亜ヒ酸排出ポンプであるArsBタンパク質を生成することが出来ないため、亜ヒ酸を細胞外に排出することが出来ず、数μM（数十～数百ppb）の亜ヒ酸に対して感受性を示す。この株に、亜ヒ酸に応答して転写抑制を解除するArsRタンパク質をコードするarsR遺伝子と、ArsRが結合して転写を抑制するDNA領域（arsRプロモーター領域、以下ParsR）、さらにその下流にレポーター遺伝子として発光タンパク質遺伝子(luxAB)を連結したプラスミド（pKLAParsR3+arsR）を導入した。構築した組換え菌の亜ヒ酸およびヒ酸に対する応答を観察した結果、亜ヒ酸に対しては環境基準である約0.13 μM以下の濃度の検出に成功したが、ヒ酸に関しては環境基準の10倍以上の濃度が検出に必要であった。
そこで今年度は、細胞内に入ったヒ酸を全て亜ヒ酸に変換することでヒ酸に対する感度を上昇させることを試みた。ヒ酸還元酵素遺伝子であるarsCを上述のレポータープラスミド中のarsRの下流に導入したプラスミドを構築し、Δars株に導入した。この株のヒ酸に対するレポーター活性を測定した結果、ヒ酸に対する感度は上がっていなかった。培地中のリン酸によってリン酸の取り込みが抑えられているため、それに付随してヒ酸の取り込みも抑えられている可能性を考え、リン酸飢餓状態で実験行なったが、やはり感度の上昇は見られなかった。現在は、arsCを菌体内で高発現させるためにカナマイシン耐性遺伝子のプロモータの下流にarsCを挿入したプラスミドを作製し、これまでの株に導入を試みている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
亜ヒ酸に対する反応については、環境基準以下を達成できたが、さらに検出感度を上げたいと考えている。これに関してはリン酸の取り込み経路の破壊を考えている。ヒ酸については試みた方法がうまくいかず、感度の上昇が思うように進まなかった。今年度さらに注力する必要がある。また昨年度得られたデータが不明瞭であったためデータの取り直しを行ったが、これに時間を割かれてしまって進度が遅れてしまった。
以上より、上記の評価とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続きヒ酸に対する感度を上げるための条件検討を行う。導入した遺伝子が正しく機能しているかのチェックを行って、予想した結果とならない理由を明らかにして、新たな方策を試みる。また、亜ヒ酸のみを測定できる系の感度をあげるため、リン酸取り込み系の破壊を試みる。Ars遺伝子群のプロモーター領域の改変も試み、S/N比の増大を実現する。以上の結果を統合して、定量性を示すことが可能かどうかを検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ヒ酸の検出感度を上げるための実験に遅れが出たため、その分予算の執行が遅れてしまった。次年度に行う実験で使用する予定である。
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