哺乳類神経回路の単一ニューロン解析システムの構築

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K14559
• 研究機関: 国立遺伝学研究所
• 研究代表者: 岩里 琢治 国立遺伝学研究所, 個体遺伝研究系, 教授 (00311332)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 神経科学 / マウス / 神経回路 / 新規手法 / 遺伝子ノックアウト / 細胞標識

研究実績の概要

哺乳類の脳は、無数の神経細胞が作る複雑なネットワーク（神経回路）として機能する。領域特異的・細胞腫特異的ノックアウトマウスを含む、従来の遺伝子ノックアウトでは、標的遺伝子が多くの神経細胞で欠損してしまうため得られた表現型がどの細胞の遺伝子欠損によって引き起こされるのか不明であり、そうした方法論の欠如が神経回路の発達や機能の分子機構を理解する上での大きな妨げとなってきた。本研究では、こうした問題を解決するために、脳の中のごく少数の神経細胞のみを標識し、その標識した細胞特異的に標的遺伝子の機能を阻害するための、汎用性の高い手法を構築することを目的とした。今年度の成果として、単一細胞の標識と同時に標識細胞特異的に遺伝子ノックアウトができる簡便で効率のよい方法の開発に成功した。この方法では、二種類のベクターを脳に導入することにより、ベクターが導入された細胞のうちの一部でのみ遺伝子発現が増幅され、少数の細胞のみが極めて明るく蛍光標識された。また、floxマウスを用いたり、あるいは第三のベクターを同時に導入したりすることにより、標識された細胞特異的に遺伝子をノックアウトできる画期的なシステムとなった。特に遺伝子を操作するためにTALEN, CRISPR/Cas9などの最新のゲノム編集技術を取り入れることで、高性能で汎用性のある方法の構築に成功した。その結果、遺伝子組換動物ではない多くのモデル生物においても遺伝子ノックアウトができるようになった。また、ベクター導入に、これまでの子宮内電気穿孔法に加えてアデノ随伴ウイルスが利用できるようになり、幅広い組織への適用が可能となった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

おおむね順調に進展し、上記の報告を論文として発表することができた。

今後の研究の推進方策

今後は今回開発に成功した手法の汎用性をさらに高めるためにいくつかの工夫を行う。また、その検証を行い、次年度内に一報の論文としてまとめたい。

次年度使用額が生じた理由

必要となる材料を海外を含む複数の研究室から手に入れる必要があったが、それがスムーズに進まなかった。

次年度使用額の使用計画

材料を手に入れてコンストラクトを作製する。子宮内電気穿孔法により脳に導入し、効率を検定する。

研究成果

• [雑誌論文] Prenatal thalamic waves regulate cortical area size prior to sensory processing. (2017)
  • 著者名/発表者名: Moreno-Juan, V., Filipchuk, A., Antón-Bolanos, N., Mezzera, C., Gezelius, H., Andrés, B., Rodríguez-Malmierca, L., Susín, R., Schaad, O., Iwasato, T., Schuele, R., Rutlin, M., Nelson, S., Ducret, S., Valdeolmillos, M., Rijli, F., Lopez-Bendito, G.
  • 雑誌名: Nature Commun 巻: 8 ページ: 14172
  • DOI: 10.1038/ncomms14172
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo (2016)
  • 著者名/発表者名: Luo, W., Mizuno, H., Iwata, R., Nakazawa, S., Yasuda, K., Itohara, S., Iwasato, T.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 6 ページ: 35747
  • DOI: 10.1038/srep35747
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] CAPS1 stabilizes the state of readily releasable synaptic vesicles to fusion competence at CA3-CA1 synapses in adult hippocampus. (2016)
  • 著者名/発表者名: Shinoda, Y., Ishii, C., Fukazawa, Y., Sadakata, T., Ishii, Y., Sano, Y., Iwasato, T., Itohara, S., Furuichi, T.
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 6 ページ: 31540
  • DOI: 10.1038/srep31540
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] In vitro Assay for Dendritic Spine Retraction of Hippocampal Neurons with Sparse Labeling (2016)
  • 著者名/発表者名: Iwata, R., Iwasato, T.
  • 雑誌名: Bio-Protocol 巻: 6 ページ: e1937
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [学会発表] In vivo imaging of neonatal mouse barrel cortex (2016)
  • 著者名/発表者名: T. Iwasato
  • 学会等名: Dart Neuroscience Seminar Series at TSRI
  • 発表場所: SD, ＵＳＡ
  • 年月日: 2016-11-18
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Supernova: Extensible vector systems that enable high intensity single-cell labeling and labeled cell-specific gene knockout and editing In vivo (2016)
  • 著者名/発表者名: S. Nakazawa., W. Luo., R. Iwata., H. Mizuno., T. Iwasato.
  • 学会等名: Society for Neuroscience 2016
  • 発表場所: SD, USA
  • 年月日: 2016-11-12 – 2016-11-16
  • 国際学会
• [学会発表] 独自の二光子イメージング技術を用いた、新生仔マウス大脳皮質における神経回路発達の解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 岩里琢治
  • 学会等名: 第159回日本獣医学会学術集会
  • 発表場所: 藤沢
  • 年月日: 2016-09-07
  • 招待講演
• [学会発表] In vivo imaging of neonatal mouse barrel cortex (2016)
  • 著者名/発表者名: T. Iwasato.
  • 学会等名: Circuit Construction in the Mammalian Brain
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2016-08-08 – 2016-08-09
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 単一細胞蛍光標識と標識細胞特異的遺伝子操作を可能とするベクターシステム (2016)
  • 著者名/発表者名: 岩里琢治
  • 学会等名: 第13回アカデミックフォーラム
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2016-05-13
  • 招待講演
• [産業財産権] ベクターシステム、遺伝子発現方法、標的遺伝子ノックアウト方法、標的遺伝子ノックダウン方法、標的遺伝子編集方法、及び遺伝子発現キット (2016)
  • 発明者名: 岩里琢治、水野秀信、羅ブンジュウ、岩田亮平
  • 権利者名: 情報・システム研究機構
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2016-094814
  • 出願年月日: 2016-05-10