| 研究課題/領域番号 |
16K14572
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
内原 俊記 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 特任教授 (10223570)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | CLEM / Quantum dot / gold enhance / double labeling |
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| 研究実績の概要 |
免疫標識した同一対象の蛍光像と免疫電顕像を直接比較する新技術：Quantum Dot(QD)はセレン(Se)とカドミウム(Cd)からなるnanocrystal で電子密度が高くhaloをもつ粒子として電顕で確認できる一方、蛍光を発するため通常の蛍光顕微鏡でも局在を確認できる。このQD を免疫標識に用いると病変の蛍光像が観察でき、同一標本の同一部位をそのまま電顕標本として再包埋・薄切すれば、同一病変の免疫電顕像としても直接比較できるという画期的な技法を我々は開発した。しかし、これまで免疫電顕に用いられてきた金コロイド標識に比して QDは電子密度が低く、コントラストに乏しい点が弱点であった。 Energy-dispersive Xray analysis (EDX)は電顕超薄切片に電子ビームをあて、対象元素のエネルギー順位に対応したピークに対応する原子を質的に同定できる。我々は 免疫標識に用いたQDを 標本上でEDX解析し (Am J Pathol 2012; 180:4:1394-7, 2012年日本神経病理学会ポスター賞)、その成分であるSe/Cdを同定する新たな方法を発展させ、その分布を画像化する EDX mappingを世界に先駆けて完成させた (Acta Neuropathol Comm 2014;2:161- 2014年日本神経病理学会ポスター賞)。 Grayscaleと相場が決まっている免疫電顕像から標識QDのみを highlightできるこの手法は、蛍光像と対比することで、光顕レベルから分子レベルまで seamlessに連続した scaleで対象を観察できる画期的な手法となる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒト脳ホルマリン固定標本から作製した浮遊切片fluoronanogold粒子で標識し、その蛍光像でとらえた対象をトリミングして、免疫電顕としてもとらえなおして比較する新たな方法を昨年度開発した。本年度は
①マウス脳の血管内皮に発現し、血液脳関門の機能に関連するglucose transporter 1に注目した。glut 1は生理的な機能タンパクで正常構造中に局在する分子で、光顕で同定した血管の三次元構造のどの深さにglut１が位置するかを正確に同定するには光顕と電顕双方の三次元的な比較が必要となる。透過電顕像は切片のＸＹの解像度は高いが、Ｚ軸方向の解像度についての情報は得られない。今回免疫電顕の連続切片像と同一部位免疫蛍光三次元像を比較し、その内皮細胞内の局在を明確に示すことができた。
②Quantum dotはその大きさと形に依存する波長の蛍光を発するnanocrystalで、免疫標識として用いればその蛍光像と免疫電顕像を直接比較できる。異なる種類のQDで異なる抗原を免疫標識できれば二重染色が理論的に成立するが、QDの電子密度は両者の大きさや形を区別できる程には高くない。本年度は免疫標識したQDを電顕切片上で塩化金で増感した。増感により沈着した金は一様に沈着するのではなく、元のQDの形に依存して偏った金結晶を形成することを見出した。これを用いて、視認性の高い免疫電顕二重染色が、光顕と直接比較できる形で実現できた。以上の成果の一部を2019年3月にリスボンで開催されたパーキンソン病・アルツハイマー病国際会議で発表した。
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| 今後の研究の推進方策 |
QDの塩化金による増感は元のQDの形に依存して異なるパタンを呈するという2018年度の成果を踏まえ、異なる種類のQDやfluoronanogoldを組み合わせ、光顕・電顕像の直接比較が可能な多重染色法を完成する。当初の目的であるアルツハイマー病の神経原線維変化の3リピート(3R)タウ、4リピート(4R)タウの2重染色による両者の関係、glut1に関連する分子とglut1の関係などが当面の対象となるが、応用範囲は広くあらゆる領域で利用可能な新技術となることが期待される。
進行性核上性麻痺のタウは4Rのみ、アルツハイマー病のタウは3Rおよび4Rの2種類からなることが知られている。アルツハイマー病の4Rタウは279番目のアスパラギンが脱アミド化されアスパラギン酸に翻訳後不可逆的に修飾をうけることが知られている。この修飾をうけた4Rタウを特異的に検出する抗体分画を得ることに我々は世界で初めて成功し、最近論文発表した。アルツハイマー病脳では経時的にこの脱アミド化がおこると考えられ、それにつれてタウの局在や超微形態がどのように変化するかは神経原線維変化の形成過程の本質に迫る可能性がある。より力価の強い抗体を確保して、本課題で開発中の多重免疫光顕・電顕法に応用する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ヒト剖検脳を用いた多重染色による光顕と電顕の比較についての当初の課題に関するデータ取得がほぼ当該年度中に終了した。この新たな技術をさらに発展させる新規の課題として①動物標本を用いて、３次元で光顕と電顕の比較を行う。②ADとPSPで異なるタウの特徴を同定する。③様々なタウ病変を比較して診断に反映させる国際共同研究などが既に始動している。これらを学会、論文として発表する為に次年度使用が不可欠となった。
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