研究課題
神経変性疾患の動物モデルとして、様々な遺伝子改変マウスが開発されてきたが、脳のサイズや構造的類似性、高度な機能などの面から、霊長類疾患モデルの有用性は高い。本研究は、アルツハイマー病(AD)や筋萎縮性側索硬化症(ALS)をターゲットに、患者で報告されている遺伝子変異をカニクイザルに導入し、神経細胞における早期の病変の検出を試みることにより、AD/ALSの病態の理解を深めることを目的とする。遺伝子改変サルの報告は世界的にも少数に留まっており、本研究でAD/ALSモデルサルの作製に成功したならば、世界に向けて大きなインパクトを与えられる。加えて、新たな治療薬が考案された場合に、前臨床試験に用いることができ、新規治療薬開発や安全性の確保に大きな意義があると考えられる。遺伝子改変サルの作製には、① レンチウイルスを用いた遺伝子導入と、② ゲノム編集技術によるカニクイザルゲノムの改変、の２種類を予定している。平成28年度にはGFPトランスジェニックサルの作製に成功した①の技術を応用し、Swedish変異をもつヒトAPP (swAPP)遺伝子をカニクイザル受精卵に導入することを目指した。具体的には、CAGもしくはヒトHF1αプロモーター下にヒトswAPP遺伝子を組み込んだレンチウイルスを作製し、カニクイザルiPS細胞を用いて感染性やswAPPタンパク質発現の程度を確認した上で、このウイルスをカニクイザル受精卵に感染させ、swAPPトランスジェニックサルの作製を試みた。②については、カニクイザルiPS細胞を用いてCRISPR/Cas9のゲノム編集技術を応用し、家族性ALSの原因遺伝子の１つであるFUS遺伝子で報告されている変異が導入できるかどうかを検証している。
2: おおむね順調に進展している
Swedish変異をもつヒトAPP遺伝子をカニクイザル受精卵に導入し、順調に妊娠個体を得ることに成功しているため、本研究課題は概ね順調に進展している。
平成28年度に作製した、ヒトswAPP遺伝子トランスジェニックサルの産仔を得られたら、遺伝子が導入された細胞（動物全体ではキメラの可能性がある）の割合を測定し、同時に皮膚線維芽細胞よりiPS細胞を樹立して、swAPP遺伝子の発現量を計測する。swAPPトランスジェニックサルの解析は、生後１ヶ月の時点で脳を採取して詳細に調べる予定である。すなわち、生後１ヶ月齢のサルの海馬や内側嗅野を中心に、大脳皮質におけるswAPP遺伝子の発現やタンパク質の定量、Aβの沈着や神経細胞の脱落の有無などを詳細に検討する。平成29年度中には老人斑の形成までは観察されない可能性が高いが、より早期の病変を表す可能性が考えられているAβオリゴマーは検出できる可能性があると考えている。また、神経細胞に細胞死が起きていないかを、TUNEL法やcleaved Caspase-3の免疫染色を用いて解析する。もし細胞死が確認された場合は、その部位の生存している細胞をマイクロパンチ法で採取し、遺伝子発現パターンやエピゲノム修飾パターンを解析する。FUS遺伝子に、効率的にtruncation変異を起こすことができるガイドRNA配列を同定し、それを用いたCRISPR/Cas9法をカニクイザル受精卵に適用する。胚盤胞のステージまで培養系で発生させ、変異導入の効率やFUS遺伝子の発現量変化などを解析する。
すべて 2016 その他
すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (4件) (うち国際学会 3件、 招待講演 2件) 備考 (1件)
Scientific Reports
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http://www.shiga-med.ac.jp/~hqphysi1/physiol1/research/index-re.html
